MODUL PJJ
TEKNIK MIKROPROPAGASI
TANAMAN PERKEBUNAN
BIDANG PEMINATAN KULTUR JARINGAN TANAMAN
PENULIS : Ir. ETTY EKAWATI, MP
E D ITOR : Ir. HERU SUGITO, MP
PROGRAM DIPLOMA-4
MANAJEMEN AGROINDUSTRI
JOINT PROGRAM PPPPTK PERTANIAN
DAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2008
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ i
KATA PENGANTAR
Program Diploma IV adalah program yang diarahkan pada hasil lulusan yang
menguasai kemampuan dalam melaksanakan pekerjaan yang kompleks dengan dasar
kemampuan profesional tertentu dengan beban studi sekurang-kurangnya 144 sks dan
sebanyak-banyaknya 160 sks yang dapat ditempuh kurang dari 8 semester dan
selama-lamanya 14 semester.
Dalam rangka efisiensi dan efektifitas pelaksanaan program diploma, maka Program
Diploma-4 joint program PPPPTK Pertanian dan Poltiteknik Negeri Jember angkatan
2007/2008 ditargetkan akan diselesaikan dalam 40 bulan sehingga waktu magang
angkatan 2006/2007 dilaksanakan selama ± 12 bulan maka pada angkatan 2007/2008
hanya akan dilaksanakan selama 4 bulan. Namun setelah dianalisis ternyata magang
selama 4 bulan tersebut belum dapat mencukupi seluruh target kompetensi maupun
persyaratan yang harus dicapai, oleh karena itu magang ditargetkan selama 6 bulan.
Sedangkan apabila magang dilakukan selama 6 bulan maka waktu pelaksanaan
semester 4 (semester pasca magang) menjadi berkurang yaitu hanya 2 bulan. Dalam
rangka tercapainya target kurikulum pada semester 4 maka teori-teori pada mata kuliah
semester 4 akan dilaksanakan melalui program PJJ, yang tentunya memerlukan suatu
bahan ajar berupa modul yang dapat digunakan siswa untuk belajar tanpa tatap muka
dengan dosen. Oleh karena pada tahun ini telah disusun sejumlah 67 modul yang
dibekalkan kepada mahasiswa yang akan berangkat PKL sebagai pengganti teori
semester 4 sehingga efisiensi dan efektifitas pelaksanaan pembelajaran dapat tetap
tercapai sesuai target. Dalam rangka menyelesaikan pembelajaran melalui modul
tersebut, selama pelaksanaan PKL mahasiswa diwajibkan tetap berkomunikasi dan
melakukan konsultasi dengan dosen sesuai dengan potensi dan aturan yang
ditetapkan.
Program Diploma IV
Manajemen Agroindustri
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ ii
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ............................................................................................. i
DAFTAR ISI............................................................................................................ ii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................... v
DAFTAR TABEL ................................................................................................... vi
I PENDAHULUAN ............................................................................................ 1
A Latar belakang ........................................................................................ 1
B Tujuan ..................................................................................................... 2
II TUJUAN PEMBELAJARAN ........................................................................... 3
A Tujuan Umum .......................................................................................... 3
B Tujuan Khusus......................................................................................... 3
III KEGIATAN BELAJAR .................................................................................. 4
A KEGIATAN BELAJAR-1 .......................................................................... 4
1. LEMBAR INFORMASI-1 (Perbanyakan Mikro/Mikropropagasi)..........
a. Manfaat Teknik Mikropropagasi ....................................................
b. Metode Perbanyakan Mikro Secara Invitro ..................................
c. Faktor-faktor yang Berpengaruh pada Keberhasilan
Mikropropagasi .............................................................................
d. Macam-macam Mikropropagasi ...................................................
2. TUGAS-1 ...........................................................................................
3. TES FORMATIF-1 ..............................................................................
4. UMPAN BALIK dan TINDAK LANJUT-1 ............................................
5. KUNCI JAWABAN TES FORMATIF-1 ...............................................
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
4
6
7
14
20
25
26
27
27
29
B KEGIATAN BELAJAR-2 .......................................................................... 30
1. LEMBAR INFORMASI-2 (Kultur Kalus dan Suspensi Sel) .................
a. Kultur Kalus ..................................................................................
b. Kultur Suspensi .............................................................................
c. Suspensi Sel untuk Memproduksi Senyawa Metabolik Sekunder.
2. TUGAS-2 ............................................................................................
3. TES FORMATIF-2 ..............................................................................
30
30
34
35
45
45
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ iii
4. UMPAN BALIK dan TINDAK LANJUT-2 ............................................
5. KUNCI JAWABAN TES FORMATIF-2 ...............................................
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
46
47
49
C KEGIATAN BELAJAR-3 .......................................................................... 51
1. LEMBAR INFORMASI-3 (Produksi Tanaman Haploid) ......................
a. Kegunaan Haploid dalam Pemuliaan Tanaman ............................
b. Teknik Mendapatkan Tanaman Haploid Secara Invitro ................
2. TUGAS-3 ............................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
51
51
52
59
60
D KEGIATAN BELAJAR-4 .......................................................................... 61
1. LEMBAR INFORMASI-4 (Silangan Secara Invitro/Invitro Pollination)
a. Perkembangan Gametofit Betina .................................................
b. Penyerbukan (Polinasi) ................................................................
c. Pembuahan (Fertilization) .............................................................
d. Kendala dalam Persilangan .........................................................
e. Prosedur Umum Pembuahan Invitro .............................................
f. Aplikasi Fertilisasi Invitro ...............................................................
2. TUGAS-4 ............................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
61
61
61
63
63
65
67
67
69
E KEGIATAN BELAJAR-5 .......................................................................... 70
1. LEMBAR INFORMASI-5 (Kultur Embrio dan Penyelamatan
Embrio/Embryo Culture and Embryo Rescue) ...................................
a. Penggolongan Kultur Embrio .......................................................
b. Aplikasi Praktis Kultur Embrio .......................................................
c. Teknik Dasar Kultur Embrio .........................................................
2. TUGAS-5 ...........................................................................................,
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
70
71
73
74
77
78
F KEGIATAN BELAJAR-6 .......................................................................... 79
1. INFORMASI-6 (Kultur Protoplasma dan Fusi
Protoplasma/Hibridisasi Somatik) .......................................................
a. Pengertian Kultur Protoplasma ....................................................
b. Organ Sebagai Sumber Protoplasma ...........................................
c. Prosedur Kultur Protoplasma ........................................................
d. Silangan Somatik ..........................................................................
e. Fusi Protoplasma ..........................................................................
79
79
79
81
90
91
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ iv
2. TUGAS-6 ............................................................................................
3. TES FORMATIF-6 ..............................................................................
4. UMPAN BALIK dan TINDAK LANJUT-6 ............................................
5. KUNCI JAWABAN TES FORMATIF-6 ...............................................
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
94
94
95
95
97
LAMPIRAN (SAP) .......................................................................................... 98
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ v
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Teknik Mikropropagasi dari Eskplan Diinisiasi Langsung untuk
Membentuk Multiplikasi Tunas ................................................................... 14
2 Fertilisasi Plasenta; Bakal buah dipotong melintang selanjutnya pollen
ditaburkan pada ovule ................................................................................. 71
3 Embrio Nonzigotik Dihasilkan dari Kultur Pollen atau Protoplasma yang
Nyata Berkembang dari Sel Tunggal............................................................ 77
4 Skema Isolasi dan Kultur Embrio ................................................................. 80
5 Sel Mesofil Daun .......................................................................................... 86
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kandungan Senyawa Kimia pada Berbagai Marga Tanaman dan
Manfaatnya .................................................................................................. 42
2 Perbandingan Komposisi Dinding Sel Primer dan Sekunder ...................... 88
3 Formula Media Kultur Protoplasma Tembakau ........................................... 93
4 Jumlah Kromosom dalam Beberapa Persilangan Interspesifik dan
Intergenerik yang Diproduksi melalui Peleburan Protoplasma .................... 99
5 Pemindahan Sifat Genetik melalui Peleburan Protoplasma ........................ 99
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penyediaan bibit dalam pengembangan suatu tanaman atau dalam suatu proses
produksi merupakan salah satu aspek yang sangat penting. Proses produksi skala
besar seperti perkebunan akan memerlukan bibit dalam jumlah besar, bibit dari
varitas unggul, bebas dari hama dan penyakit, dan penyediaan kontinu.
Bibit dari suatu varitas unggul yang dihasilkan oleh pemulia tanaman jumlahnya
sangat terbatas, sedangkan bibit yang dibutuhkan sangat banyak. Beberapa
tanaman perkebunan banyak yang sulit diperbanyak dengan cara konvensional baik
secara vegetatif maupun generatif, selain itu bila diperbanyak dengan cara cangkok,
stek, atau penempelan memerlukan bahan tanaman yang sangat besar untuk
mendapatkan bibit dalam jumlah besar.
Dengan berkembangnya teknik mikropropagasi tanaman akhir-akhir ini, kendala
dalam multiplikasi untuk beberapa jenis tanaman dapat diatasi. Teknik ini pada
mulanya ditujukan untuk membuktikan kebenaran teori totipotensi, yang selanjutnya
berkembang untuk penelitian di bidang fisiologi tanaman dan biokimia. Perbanyakan
tanaman dengan teknik ini memiliki kelebihan, yaitu tanaman dapat diperbanyak
setiap saat tanpa tergantung musim karena dilakukan di ruang tertutup, daya
multiplikasinya tinggi dari bahan tanaman yang kecil, tanaman dihasilkan seragam,
dan bebas penyakit terutama bakteri dan jamur.
Jenis tanaman yang diperbanyak dengan teknik mikropropagasi ditujukan terutama
yang meghadapi masalah seperti daya perkecambahan bijinya rendah, tanamantanaman
hibrida yang tetua jantannya steril, tanaman langka, dan tanaman yang
selalu diperbanyak dengan cara vegetattif.
Di negara-negara maju seperti Amerika Serikat, Jepang, dan negara-negara Eropa,
teknik mikropropagasi tanaman sudah lama berkembang bukan hanya untuk
perbanyakan tetapi juga untuk tujuan lain seperti:
1, Mendapatkan tanaman bebas penyakit terutama virus
2. Memproduksi senyawa metabolit sekunder
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 2
3. Perbaikan tanaman, misalnya melalui memanipulasi jumlah kromosom, polinasi
invitro, penyelamatan embrio yang secara normal abortif, pembuatan tanaman
haploid melalui kultur polen, kultur ovul, pembuatan tanaman hibrida somatik
melalui fusi protoplasma baik intraspesifik, maupun interspesifik, transfer DNA
atau organel untuk suatu sifat yang dikehendaki
4. Pelestarian plasma nutfah berupa sel atau organ-organ tumbuh yang dapat
diregenerasikan menjadi tanaman lengkap bila diperlukan.
B. Tujuan
Modul ini disusun dengan tujuan ;
1. Sebagai salah satu referensi bagi mahasiswa
2. Membantu mahasiswa dalam memecahkan permasalahan perbanyakan/
pembiakan tanaman secara mikropropagasi
3. Menambah wawasan bagi mahasiswa
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 3
II. TUJUAN PEMBELAJARAN
Dalam modul ini Anda dapat mempelajari wawasan pengetahuan mengenai teknik
perbanyakan tanaman melalui mikropropagasi tanaman secara umum, sebagai
pengantar untuk mempelajari modul-modul khusus yang membahas lebih rinci tentang
aspek-aspek khusus teknik kultur jaringan. Kegiatan-kegiatan pekerjaan teknik
mikropropagasi merupakan pekerjaan laboratoris yang memerlukan penguasaan
sejumlah keterampilan tertentu, penguasaan pengetahuan pendukung yang memadai
tentang teknik perbanyakan tanaman secara umum, dan sikap yang mendukung bagi
keberhasilan pekerjaan tersebut di dalam laboratorium.
A. Tujuan Umum
Setelah mempelajari modul ini diharapkan Anda mampu memahami tentang seluk
beluk dan tatacara pengembangbiakan tanaman melalui teknik mikropropagasi
B. Tujuan Khusus
Setelah mempelajari modul ini diharapkan Anda mampu:
1. Memahami manfaat, metode, macam-macam, dan faktor-faktor yang
mempengaruhi keberhasilan perbanyakan mikro (mikropropagasi)
2. Melakukan kultur kalus dan suspensi sel
3. Melakukan produksi tanaman haploid
4. Melakukan silangan secara invitro
5. Melakukan kultur embrio dan penyelamatan embrio
6. Melakukan kultur protoplasma dan fusi protoplasma
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 4
III. KEGIATAN BELAJAR
A. KEGIATAN BELAJAR-1
1. Lembar Informasi-1
PERBANYAKAN MIKRO (MIKROPROPAGASI)
Propagasi klonal invitro dikenal dengan istilah mikropropagasi. Kata klon
digunakan pertama kali oleh Webber untuk tanaman budidaya yang dihasilkan
dari propagasi vegetatif. Jadi propagasi klonal adalah multiplikasi dari individu
gen identik melalui reproduksi aseksual sedangkan klon itu sendiri adalah satu
populasi tanaman derivat (turunan) dari satu individu tunggal yang dihasilkan
melalui reproduksi aseksual.
Seiring dengan perkembangan pemahaman dan kemajuan kultur jaringan maka
dewasa ini teknik-teknik kultur jaringan telah digunakan untuk berbagai tujuan
termasuk industri bibit tanaman. Teknik perbanyakan mikro (mikropropagasi)
telah lama digunakan dan merupakan salah satu contoh menarik dan klasik dari
penerapan teknik kultur jaringan. Teknik ini dilakukan dengan cara menanam
eksplan berupa pucuk beserta jaringan meristemnya yang dikenal sebagai teknik
kultur pucuk (shoot tip culture) atau menanam tunas lateral dengan satu atau
lebih buku (single node and multiple node culture). Teknik terakhir juga dikenal
dengan istilah invitro layering.
Perbanyakan mikro secara umum dapat diartikan sebagai usaha menumbuhkan
bagian tanaman dalam media aseptis kemudian memperbanyak bagian
tanaman tersebut sehingga dihasilkan tanaman sempurna dalam jumlah banyak.
Tujuan utamanya adalah memproduksi tanaman dalam jumlah besar dan waktu
yang singkat.
Teknik ini juga dikenal dengan upaya clonning untuk memproduksi klon tanaman
dari jaringan vegetatif. Oleh karena itu tanaman yang dihasilkan melalui upaya
clonning ini adalah identik atau serupa dengan induknya. Untuk mengenal lebih
jauh tentang mikropropagasi akan dibahas tentang:
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 5
a. Manfaat Teknik Mikropropagasi
b. Metode Perbanyakan Secara Invitro
c. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan Perbanyakan Tanaman
secara Invitro
d. Macam-macam Mikropropagasi.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 6
a. Manfaat Teknik Mikropropagasi
Manfaat Mikropropagasi dalam Pemuliaan Tanaman
Teknik mikropropagasi dalam pemuliaan tanaman pada umumnya digunakan
antara lain, untuk:
1) Menghasilkan tanaman bebas penyakit (nematoda, mycoplasma, viroid,
virus,dan jamur)
2) Menghasilkan kultivar baru atau tanaman superior, hybrid baru, seleksi dan
klon lokal, dan genotip elit
3) Menghasilkan galur tetua jantan steril
4) Menghasilkan induksi mutan secara spontan
5) Membuat variasi genetik.
Selain manfaatnya tersebut, perbanyakan dengan teknik kultur jaringan ini juga
memiliki kelemahan antara lain agar usaha ini berhasil diperlukan ketrampilan
khusus, fasilitas pendukung produksi yang khusus, diperlukan metode-metode
khusus untuk mengoptimalkan produksi masing-masing varietas tanaman dan
spesies, dan karena metode yang dewasa ini tersedia membutuhkan banyak
tenaga kerja maka biaya produksinya umumnya tinggi.
Selain hal tersebut dapat terjadi variasi tanaman yang dihasilkan dari
perbanyakan secara invitro sehingga tanaman yang dihasilkan berbeda dengan
induknya. Variasi ini dikenal dengan istilah variasi somaklonal karena variasi
muncul pada klon yang dihasilkan dari organ-organ somatik (vegetatif). Hal ini
dapat terjadi karena tanaman terus menerus dan dalam waktu lama ditanam dan
diperbanyak dalam media yang mengandung hormon pertumbuhan tertentu.
Variasi ini juga timbul bilamana eksplan ditanam dalam media yang
memungkinkan terbentuknya kalus. Pembelahan sel yang sangat cepat pada
kalus dapat mengakibatkan perubahan genetis sel-sel kalus akibat
penyimpangan informasi genetis yang diterima oleh masing-masing sel kalus
tersebut. Variasi somaklonal ini dapat dikurangi dengan cara:
1) Membatasi jumlah sub-kultur dan perbanyakannya,
2) Menanam dalam medium tanpa hormon pertumbuhan untuk satu atau dua
periode sub kultur dan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 7
3) Jika memungkinkan menghindari perbanyakan melalui kultur kalus. Namun
pada beberapa jenis tanaman, terutama tanaman yang tidak bisa
diperbanyak dengan stek dan sulit dirangsang pembentukan tunas-tunas
adventifnya maka kultur kalus yang diregenerasikan melalui organogenesis
dan embryogenesis merupakan alternatif perbanyakan yang memungkinkan.
Apabila variasi somaklonal tidak dapat dihindari, perlu dilakukan pengujian
sifat-sifat tanaman yang diregenerasikan sebelum klon dijual secara
komersial.
b. Metode Perbanyakan Mikro Secara Invitro
Metode perbanyakan vegetatif tanaman secara invitro adalah merupakan
pengembangan dari teknik-teknik perbanyakan vegetatif yang telah dilakukan
secara konvensional seperti stek, layering dan cangkok. Tujuan perbanyakan
konvensional, misalnya stek, adalah merangsang terbentuknya organ adventif
(akar pada stek batang, akar dan tunas pada stek daun dan stek akar) pada
bahan stek dan jumlah bibit yang diperoleh dari satu bahan stek umumnya hanya
satu. Pada perbanyakan vegetatif secara invitro umumnya digunakan tidak hanya
untuk merangsang terbentuknya organ tanaman (akar, batang dan daun) namun
juga memperbanyaknya sebelum tanaman kecil (plantlet) ini dipindahkan dari
tabung kultur ke lapangan.
Metode yang dapat dilakukan dalam mikropropagasi tanaman dilakukan secara
bertahap sejak tahap persiapan dan perlakukan stok tanaman (tahap 0) sampai
tahap aklimatisasi (tahap IV).
Di atas telah dijelaskan bahwa mikropropagasi dilakukan dalam beberapa
tahapan. Tahapan-tahapan ini bukan hanya menjelaskan prosedur
mikropropagasi, namun juga menjelaskan saat perubahan pada lingkungan kultur
misalnya perubahan komposisi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang
digunakan dalam media. Ada lima tahapan dalam mikropropagasi, yaitu:
Tahap 0: tahap persiapan (preparasi)
Tahap 1: tahap induksi (pemacuan)
Tahap 2: tahap multiplikasi (perbanyakan)
Tahap 3: tahap pengakaran
Tahap 4: tahap transplantasi (pemindahahan) ke media terrestrial.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 8
Tahap 0: persiapan (preparasi), seleksi dan persiapan pohon induk
Tahapan ini dilakukan sebelum eksplan diambil untuk perbanyakan. Pohon induk
yang akan digunakan sebagai sumber eksplan harus dipilih secara hati-hati.
Pohon ini adalah pohon dari spesies atau verietas yang akan diperbanyak,
mempunyai vigor yang sehat dan bebas dari gejala serangan hama atau
penyakit. Pohon induk atau bagian tanaman yang akan diambil sebagai eksplan
perlu diperlakukan khusus agar mikropropagasi berhasil.
Perlakuan-perlakuan tersebut antara lain :
1) Penanaman di green house atau pot untuk mengurangi sumber kontaminan
2) Pemberian lingkungan yang sesuai atau perlakuan kimia untuk meningkatkan
kecepatan multiplikasi dalam kondisi invitro
3) Indexing atau prosedur lain untuk mengetahui adanya penyakit sistemik oleh
virus atau bakteri
4) Perangsangan pertumbuhan tunas-tunas dorman.
Pada permulaan pengerjaan kultur jaringan problem terbesar yang dihadapi
adalah mengatasi kontaminasi. Tempat pengambilan eksplan sangat berpengaruh
terhadap besarnya resiko kontaminasi oleh infeksi jamur. Eksplan yang diambil
dari rumah kaca yang terjamin kondisi kehegienisannya akan jauh dapat
mengurangi resiko terkontaminasi oleh infeksi jamur dibanding bila eksplan
diambil dari lapangan. Namun ada yang lebih sulit untuk menghindari kontaminasi
terhadap bakteri, karena sering sulit untuk membedakan apakah kontaminasi
tersebut berasal dari bakteri endogin atau eksogin.
Idealnya tanaman induk yang akan dijadikan sebagai eksplan sebaiknya ditanam
di dalam rumah kaca yang terjaga kehegienisannya. Ini tidak hanya dapat
mereduksi populasi jumlah mikroorganisme yang hidup di permukaan tanaman,
tetapi juga membantu untuk memproduksi tanaman berkualitas.
Pada tahap 0 termasuk juga beberapa intervensi yang dapat membuat eksplan
lebih sesuai atau lebih siap sebagai material awal. Faktor-faktor yang
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 9
berpengaruh dalam tanaman induk yang dimikropropagasi adalah cahaya,
temperatur dan zat pengatur tumbuh.
Tahap 1 : tahap awal atau induksi (inisiasi)
Tahap awal ini sangat penting dan menentukan bagi keberhasilan mikropropagasi.
Keberhasilan tahap ini pertama kali terlihat dari keberhasilan penanaman eksplan
pada kondisi aseptis (bebas dari segala kontaminan) dan harus diikuti dengan
pertumbuhan awal eksplan sesuai tujuan penanamannya (misalnya: perpanjangan
pucuk, pertumbuhan awal tunas, atau pertumbuhan kalus pada eksplan). Setelah
􀀔􀂱2 minggu inkubasi, kultur yang terkontaminasi oleh bakteri atau jamur (baik
pada media maupun eksplannya) dibuang. Tahap ini selesai dan kultur bisa
dipindahkan ke tahap berikutnya bila eksplan yang tidak terkontaminasi telah
tumbuh sesuai dengan harapan (misalnya tunas lateral atau tunas adventif
tumbuh). Untuk eksplan yang mengalami kontaminasi berat atau yang sulit untuk
disterilisasi maka eksplan terlebih dahulu dapat ditanam pada media inkubasi atau
establishment yaitu media yang hanya mengandung gula dan agar saja dengan
tujuan untuk isolasi eskplan yang tidak terkontaminasi sebelum diinisiasi pada
tahap 1 mikropropagasi.
Tujuan dari tahap ini adalah memproduksi kultur axenic. Untuk kebanyakan
pekerjaan mikropropagasi, eksplan yang dipilih adalah tunas aksilar atau terminal.
Faktor-faktor yang berpengaruh pada keberhasilan pada tahap ini adalah:
1) Umur tanaman induk
2) Umur fisiologis dari eksplan
3) Tahap perkembangan dari eksplan
4) Ukuran dari eksplan.
Reaksi hipersensitif
Ketika jaringan tanaman diekspos pada situasi stress seperti luka mekanikal,
metabolisme fenolik komplek terstimulasi. Intervensi ini menyebabkan reaksi
hipersensitif, seperti:
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 10
1) Melepaskan isi sel-sel yang rusak
2) Reaksi-reaksi di dalam sel-sel tetangganya tetapi tanpa menunjukkan gejala
adanya luka itu sendiri
3) Dan/atau mati prematur dari sel-sel yang spesifik dalam lingkungan luka atau
tempat infeksi.
Pada umumnya metabolisme fenolik komplek mempunyai 3 tipe reaksi dalam
merespon stress atau luka, yaitu:
1) Oksidasi dari terbentuknya fenolik komplek (munculnya senyawa quinon dan
material polymerisasi)
2) Pembentukan turunan monomerik
3) Pembentukan turunan polimer fenolik.
Pembentukan monomer fenolik di dalam jaringan dapat memacu untuk
mengakumulasi sejumlah besar produk, atau munculnya produk baru yang
berperan dalam mekanisme proteksi dari jaringan yang luka. Peranan dari pruduk
ini dapat membentuk pembatas fisik melawan invasi (seperti lignin), atau senyawa
inhibitor dari pertumbuhan mikrobia (seperti quinon atau fitoalexin).
Umumnya, jaringan mengandung senyawa fenolik komplek berkonsentrasi tinggi,
maka jaringan tersebut sulit untuk dikulturkan. Senyawa fenol adalah produk yang
labil dan sangat mudah teroksidasi dan fenol teroksidasi dapat menjadi fitotoksit.
Strategi untuk mereduksi atau menghilangkan senyawa fenolik komplek tersebut
adalah:
1) Mencuci atau membersihkan produk senyawa fenolik komplek dengan
membersihkannya dengan merendam kedalam air pada jangka yang panjang
atau mengabsorbsinya dengan arang aktif atau senyawa polyvinylpyrrolidone)
2) Menghambat kerja enzim fenolase menggunakan agen khelat
3) Mereduksi aktifitas fenolase dan kemampuan substrat dengan menggunakan
pH rendah, dengan penambahan senyawa antioksidan seperti: asam askorbat,
asam sitrat atau menginkubasikan kultur di dalam ruang gelap
4) Mereduksi terjadinya stress pada eksplan, terutama pada waktu sterilisasi atau
penanaman, induk tanaman yang higienis dapat mengurangi stress
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 11
5) Penggunaan mikroelemen tertentu dapat menstimulasi terbentuknya senyawa
fenol, seperti Mn2+ (berperan sebagai cofactor peroksidasi) dan Cu2+
(merupakan bagian dari enzim fenolase komplek). Oleh karena itu untuk
jaringan yang menghasilkan fenolik komplek berlebihan disarankan untuk
mengurangi konsentrasi atau tidak menggunakan unsur tersebut dalam media.
6) Menginkubasikan kultur dalam ruangan yang bersuhu rendah
7) Sebaiknya sebelum eksplan ditanam pada media perlakuan ditempatkan pada
media tanpa zat pengatur tumbuh untuk mengurangi terjadinya pencoklatan
atau penghitaman pada eksplan.
Tahap 2: tahap perbanyakan (multiplikasi)
Tujuan dari tahapan ini adalah untuk memperoleh dan memperbanyak tunas.
Kultur axenik yang telah dihasilkan pada tahap 1 dan pada tahap 2 dipindahkan
pada media yang kaya akan sitokinin agar eksplan dapat menghasilkan tunas
yang banyak yang selanjutnya pada tahap 3 nanti tunas-tunas tersebut
dipindahkan pada media pengakaran untuk memacu pertumbuhan akar.
Pada tahap ini, eksplan dapat juga membentuk kalus (callogenesis) atau
membentuk tunas (caulogenesis). Pada pertumbuhan kalus sering dihasilkan
embrioid dan setiap embrioid nantinya akan membentuk individu tanaman baru
(somatic embriogenesis), atau kadang memproduksi meristemoid yang akan
tumbuh menjadi tunas (organogenesis). Callogenesis sering menimbulkan
terjadinya aberasi genetik yang dikenal dengan istilah variasi somaklonal,
sehingga tanaman yang dihasilkan tidak identik dengan tanaman induknya.
Tunas yang diperoleh pada tahapan ini digunakan sebagai bahan perbanyakan
berikutnya, oleh karena itu pada tahapan ini dilakukan banyak sub kultur untuk
melipatgandakan jumlah plantlet yang dihasilkan. Pada tahapan ini, tunas yang
dihasilkan dipotong-potong dengan teknik single-node/multiple node culture
maupun dengan mengambil pucuknya sebagai eksplan untuk perbanyakan.
Bahan tersebut kemudian ditanam pada media baru yang umumnya mengandung
sitokinin pada konsentrasi yang lebih tinggi dari auksin. Pada tahap ini dapat
digunakan media cair (media tanpa agar), semi padat maupun media padat.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 12
Dengan modifikasi media yang sesuai, tunas-tunas baru akan tumbuh dari
potongan eksplan. Tahapan ini umumnya dilakukan sebanyak 8􀂱10 kali sehingga
akan dapat dihasilkan sejumlah besar tunas (ribuan tunas) dari satu eksplan pada
tahapan inisiasi. Tunas tersebut selanjutnya dibesarkan atau diakarkan pada
tahap mikropropagasi berikutnya.
Tahap 3: persiapan plantlet sebelum aklimatisasi (tahapan penangkaran)
Tunas atau plantlet yang dihasilkan dari tahapan ke 2 tersebut umumnya masih
sangat kecil atau tunas yang belum dilengkapi dengan akar sehingga belum
mampu untuk mendukung pertumbuhannya dalam kondisi invivo. Oleh karena itu,
dalam tahap ini masing-masing plantlet yang dihasilkan ditumbuhkan untuk
pembesaran, pengakaran dan perangsangan aktifitas fotosintesisnya. Teknik
untuk mendapatkan plantula yang siap untuk di pindahkan ke media terrestrial
pada tahap 4 antara lain, adalah:
1) Media untuk pengakaran dan perpanjangan tunas. Media perakaran yang
digunakan tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Kluster tunas yang
dihasilkan pada tahap 2 disimpan pada media tanpa ZPT dengan kelembaban
yang sangat tinggi
2) Individu tunas (propagul) disubkultur ke media dengan mengurangi konsentrasi
atau tanpa penambahan sitokinin dan menambah konsentrasi auksin serta
kadang dengan mengurangi konsentrasi senyawa anorganik. Pada beberapa
jenis tanaman pengakaran dapat dilakukan dengan cara menempakan tunas
hasil tahap 2 (propagul) diletakkan pada aerasi media cair lebih baik dari pada
pada media padat. Atau dengan cara memindahkan propagul ke media yang
berisi auksin selama 1-2 hari, kemudian disubkultur lagi ke media tanpa auksin
(induksi akar dipacu oleh adanya auksin, tetapi pertumbuhan akar dapat
dihambat oleh keberadaan auksin dalam media). Atau propagul dicelupkan
dalam larutan pangakaran (auksin) sebentar dan selanjutnya ditanam dalam
medium tanpa auksin
3) Tahapan pemanjangan ini dapat ditempuh dengan cara meletakkan propagul
pada medium agar tanpa sitokinin atau dengan konsentrasi yang sangat
rendah selamas 2-4 minggu. Pada beberapa tanaman menggunakan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 13
penambahan GA3 dalam medium. Selanjutnya propagul dipindahkan ke media
lainnya seperti teknik sebelumnya
4) Penggunaan media praaklimatisasi dan lingkungan kultur dengan penyinaran
yang lebih intensitas cahayanya untuk perangsangan aktifitas fotosintesis
misalnya penggunaan media dengan konsentrasi gula rendah/tanpa gula,
penambahan intensitas cahaya, dan perlakuan dengan carbon dioksida.
Tahap 4 : aklimatisasi
Tahapan aklimatisasi ini adalah tahap pemindahan plantet dari kondisi invitro ke
kondisi invivo. Tahap ini sangat penting dan harus dilakukan secara hati-hati,
karena jika tidak dilakukan dengan baik maka sebagian besar plantet yang
dihasilkan dapat mati/musnah. Plantlet dikeluarkan dari botol dan agar yang
melekat pada akarnya dibersihkan, direndam dalam larutan fungisida, lalu ditanam
dalam kompos atau medium porous yang bersih untuk merangsang pembentukan
akar-akar serabutnya. Untuk mencegah kematian plantlet akibat transpirasi,
plantlet disungkup dengan plastik atau ditempatkan pada ruangan dengan
kelembaban tinggi, dengan suhu ruangan dan diletakkan ditempat yang ternaungi
dengan intensitas cahaya 30%. Pada kasus tertentu, daun tanaman disemprot
dengan anti transpirant (misalnya Abscicic acid) untuk mencegah penguapan
yang terlalu besar dari daun. Secara perlahan, kelembaban dikurangi dan
intensitas cahaya ditambah untuk merangsang fotosintesis.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 14
Gambar 1. Teknik Mikropropagasi: dari eksplan diinisiasi langsung untuk
membentuk multiplikasi tunas; eksplan dapat berasal dari jaringan
meristem, pucuk atau tunas samping (sumber: Taji, Kumar &
Lakshmanan, 2002).
c. Faktor-faktor yang Berpengaruh pada Keberhasilan Mikropropagasi
1) Genotip tanaman
Salah satu faktor yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis
eksplan dalam kultur invitro adalah genotip tanaman asal eksplan diisolasi.
Hasil-hasil penelitian menunjukkan bahwa respon masing-masing eksplan
tanaman sangat bervariasi tergantung dari spesies, bahkan varietas, atau
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 15
tanaman asal eksplan tersebut. Pengaruh genotip ini umumnya berhubungan
erat dengan faktor-faktor lain yang mempengaruhi pertumbuhan eksplan,
seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur. Oleh
karena itu, komposisi media, zat pengatur tumbuh dan lingkungan
pertumbuhan yang dibutuhkan oleh masing-masing varietas tanaman
bervariasi meskipun teknik kultur jaringan yang digunakan sama.
Perbedaan respon genotip tanaman tersebut dapat diamati pada perbedaan
eksplan masing-masing varietas untuk tumbuh dan beregenerasi. Masingmasing
varietas tanaman berbeda kemampuannya dalam merangsang
pertumbuhan tunas aksilar, baik jumlah tunas maupun kecepatan
pertumbuhan tunas aksilarnya. Hal serupa juga terjadi pada pembentukan
kalus, laju pertumbuhan kalus serta regenerasi kalus menjadi tanaman
lengkap baik melalui pembentukan organ-organ adventif maupun embrio
somatik. Regenerasi dan perkembangan organ adventif dan embrio somatik
juga sangat ditentukan oleh varietas tanaman induk. Perbedaan pengaruh
genetik ini disebabkan karena perbedaan kontrol genetik dari masing-masing
varietas serta jenis kelamin tanaman induk.
2) Media kultur
Perbedaan komposisi media, komposisi zat pengatur tumbuh dan jenis media
yang digunakan akan sangat mempengaruhi pertumbuhan dan regenerasi
eksplan yang dikulturkan.
a) Komposisi media. Perbedaan komposisi media, seperti jenis dan komposisi
garam-garam anorganik, senyawa organik, zat pengatur tumbuh sangat
mempengaruhi respon eksplan saat dikulturkan. Perbedaan komposisi
media biasanya sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi
eksplan. Meskipun demikian, media yang telah diformulasikan tidak hanya
berlaku untuk satu jenis eksplan dan tanaman saja. Beberapa jenis
formulasi media bahkan digunakan secara umum untuk berbagai jenis
eksplan dan varietas tanaman, seperti media MS. Namun ada juga
beberapa jenis media yang diformulasikan untuk tanaman-tanaman tertentu
misalnya WPM, VW dll. Media-media tersebut dapat digunakan untuk
berbagai tujuan seperti perkecambahan biji, kultur pucuk, kultur kalus,
regenerasi kalus melalui organogenesis dan embriogenesis. Media yang
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 16
dibutuhkan untuk perkecambahan biji, perangsangan tunas-tunas aksilar
umumnya lebih sederhana dibandingkan dengan media untuk regenerasi
kalus baik melalui organogenesis maupun embryogenesis.
b) Komposisi hormon pertumbuhan. Komposisi dan konsentrasi hormon
pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah
pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan
konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur
sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan
pengkulturannya. Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang
ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan
serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada
eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui
percobaan-percobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan
untuk mengetahui komposisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan
kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan.
Hormon pertumbuhan yang digunakan untuk perbanyakan secara invitro
adalah golongan auksin, sitokinin, giberelin, dan growth retardant. Auksin
yang umum dipakai adalah IAA (Indole Acetic Acid), IBA (Indole Butyric
Acid), NAA (Naphtalena Acetic Acid), dan 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy
Acetic Acid). Selain itu beberapa peneliti pada beberapa tanaman
menggunakan juga CPA (Chlorophenoxy Acetic Acid). Sitokinin yang
banyak dipakai adalah Kinetin (Furfuryl Amino Purine), BAP/BA (Benzyl
Amino Purine/Benzyl Adenine), 2 i-P (2-isopentenyl Adenin). Beberapa
sitokinin lainnya yang juga digunakan adalah zeatin, thidiazuron dan PBA
(6(benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine). Hormon pertumbuhan
golongan giberellin yang paling umum digunakan adalah GA3, selain itu ada
beberapa peneliti yang menggunakan GA4 dan GA7, sedangkan growth
retardant yang sering digunakan adalah Ancymidol, Paraclobutrazol dan
TIBA, AbA dan CCC.
c) Keadaan fisik media. Media yang umum digunakan dalam kultur jaringan
adalah medium padat, medium semi padat dan medium cair. Keadaan fisik
media akan mempengaruhi pertumbuhan kultur, kecepatan pertumbuhan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 17
dan diferensiasinya. Keadaan fisik media ini mempengaruhi pertumbuhan
antara lain karena efeknya terhadap osmolaritas larutan dalam media serta
ketersediaan oksigen bagi pertumbuhan eksplan yang dikulturkan.
Media yang umum digunakan dalam mikropropagasi adalah media semisolid
(semi padat) dengan cara menambahkan agar. Media semi padat ini
digunakan karena beberapa alasan antara lain: eksplan yang kecil mudah
terlihat dalam media padat; selama kultur eksplan tetap berada pada
orientasi yang sama; eksplan berada di atas permukaan media sehingga
tidak diperlukan teknik aerasi tambahan pada kultur; orientasi
pertumbuhan tunas dan akar tetap; dan kalus tidak pecah seperti jika
ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar dalam beberapa
kasus dapat menghambat pertumbuhan karena: agar mungkin
mengandung senyawa penghambat yang dapat menghambat morfogenesis
beberapa kultur atau memperlambat pertumbuhan kultur; eksudasi fenolik
dari eksplan terserap oleh media yang menempel dengan eksplan
sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan eksplan; agar harus dicuci
bersih dari akar sebelum diaklimatisasi; dan perlu waktu yang lebih banyak
untuk mencuci gelas kultur misalnya botol-botol harus diautoclave untuk
melarutkan agar sebelum dicuci.
3) Lingkungan Tumbuh
a) Suhu. Tanaman umumnya tumbuh pada lingkungan dengan suhu yang
tidak sama setiap saat, misalnya pada siang dan malam hari tanaman
mengalami kondisi dengan perbedaan suhu yang cukup besar. Keadaan
demikian bisa dilakukan dalam kultur invitro dengan mengatur suhu siang
dan malam di ruang kultur, namun laboratorium kultur jaringan selama ini
mengatur suhu ruang kultur yang konstan baik pada siang maupun malam
hari. Umumnya temperatur yang digunakan dalam kultur invitro lebih tinggi
dari kondisi suhu invivo. Tujuannya adalah untuk mempercepat
pertumbuhan dan morfogenesis eksplan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 18
Pada sebagian besar laboratorium, suhu yang digunakan adalah konstan,
yaitu 25°C (kisaran suhu 17-32°C). Tanaman tropis umumnya dikulturkan
pada suhu yang sedikit lebih tinggi dari tanaman empat musim, yaitu 27°C
(kisaran suhu 24-32°C). Bila suhu siang dan malam diatur berbeda, maka
perbedaan umumnya adalah 4-8°C, variasi yang biasa dilakukan adalah
25°C siang dan 20°C malam, atau 28°C siang dan 24°C malam. Meskipun
hampir semua tanaman dapat tumbuh pada kisaran suhu tersebut, namun
kebutuhan suhu untuk masing-masing jenis tanaman umumnya berbedabeda.
Tanaman dapat tumbuh dengan baik pada suhu optimumnya. Pada
suhu ruang kultur dibawah optimum, pertumbuhan eksplan lebih lambat,
namun pada suhu diatas optimum pertumbuhan tanaman juga terhambat
akibat tingginya laju respirasi eksplan.
b) Kelembaban relatif. Kelembaban relatif dalam botol kultur dengan mulut
botol yang ditutup umumnya cukup tinggi, yaitu berkisar antara 80-99%.
Jika mulut botol ditutup agak longgar maka kelembaban relatif dalam botol
kultur dapat lebih rendah dari 80%. Sedangkan kelembaban relatif di ruang
kultur umumnya adalah sekitar 70%. Jika kelembaban relatif ruang kultur
berada dibawah 70% maka akan mengakibatkan media dalam botol kultur
(yang tidak tertutup rapat) akan cepat menguap dan kering sehingga
eksplan dan plantlet yang dikulturkan akan cepat kehabisan media. Namun
kelembaban udara dalam botol kultur yang terlalu tinggi menyebabkan
tanaman tumbuh abnormal yaitu daun lemah, mudah patah, tanaman kecilkecil
namun terlampau sukulen. Kondisi tanaman demikian disebut
vitrifikasi atau hiperhidrocity. Sub-kultur ke media lain atau menempatkan
planlet kecil ini dalam botol dengan tutup yang agak longgar, tutup dengan
filter, atau menempatkan silica gel dalam botol kultur dapat membantu
mengatasi masalah ini.
c) Cahaya. Seperti halnya pertumbuhan tanaman dalam kondisi invivo,
kuantitas dan kualitas cahaya, yaitu intensitas, lama penyinaran dan
panjang gelombang cahaya mempengaruhi pertumbuhan eksplan dalam
kultur invitro. Pertumbuhan organ atau jaringan tanaman dalam kultur
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 19
invitro umumnya tidak dihambat oleh cahaya, namun pertumbuhan kalus
umumnya dihambat oleh cahaya.
Pada perbanyakan tanaman secara invitro, kultur umumnya diinkubasikan
pada ruang penyimpanan dengan penyinaran. Tunas-tunas umumnya
dirangsang pertumbuhannya dengan penyinaran, kecuali pada teknik
perbanyakan yang diawali dengan pertumbuhan kalus. Sumber cahaya
pada ruang kultur ini umumnya adalah lampu flourescent (TL). Hal ini
disebabkan karena lampu TL menghasilkan cahaya warna putih, selain itu
sinar lampu TL tidak meningkatkan suhu ruang kultur secara drastis (hanya
meningkat sedikit). Intensitas cahaya yang digunakan pada ruang kultur
umumnya jauh lebih rendah (1/10) dari intensitas cahaya yang dibutuhkan
tanaman dalam keadaan normal. Intensitas cahaya dalam ruang kultur
untuk pertumbuhan tunas umumnya berkisar antara 600-1000 lux.
Perkecambahan dan inisiasi akar umumnya dilakukan pada intensitas
cahaya lebih rendah.
Selain intensitas cahaya, lama penyinaran atau photoperiodisitas juga
mempengaruhi pertumbuhan eksplan yang dikulturkan. Lama penyinaran
umumnya diatur sesuai dengan kebutuhan tanaman sesuai dengan kondisi
alamiahnya. Periode terang dan gelap umumnya diatur pada kisaran 8-16
jam terang dan 16-8 jam gelap tergantung varietas tanaman dan eksplan
yang dikulturkan. Periode siang/malam (terang/gelap) ini diatur secara
otomatis menggunakan timer yang ditempatkan pada saklar lampu pada
ruang kultur. Dengan teknik ini penyinaran dapat diatur konstan sesuai
kebutuhan tanaman.
4) Kondisi Eksplan
Pertumbuhan dan morfogenesis dalam mikropropagasi sangat dipengaruhi
oleh keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Selain faktor
genetis eksplan yang telah disebutkan di atas, kondisi eksplan yang
mempengaruhi keberhasilan teknik mikropropagasi adalah jenis eksplan,
ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan yang digunakan sebagai eksplan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 20
Meskipun masing-masing sel tanaman memiliki kemampuan totipotensi,
namun masing-masing jaringan memiliki kemampuan yang berbeda-beda
untuk tumbuh dan beregenerasi dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, jenis
eksplan yang digunakan untuk masing-masing kultur berbeda-beda tergantung
tujuan pengkulturannya.
Umur eksplan sangat berpengaruh terhadap kemampuan eksplan tersebut
untuk tumbuh dan beregenerasi. Umumnya eksplan yang berasal dari jaringan
tanaman yang masih muda (juvenil) lebih mudah tumbuh dan beregenerasi
dibandingkan dengan jaringan yang telah terdiferensiasi lanjut. Jaringan muda
umumnya memiliki sel-sel yang aktif membelah dengan dinding sel yang
belum kompleks sehingga lebih mudah dimodifikasi dalam kultur dibandingkan
jaringan tua. Oleh karena itu, inisiasi kultur biasanya dilakukan dengan
menggunakan pucuk-pucuk muda, kuncup-kuncup muda, hipokotil,
inflorescence yang belum dewasa, dll. Jika eksplan diambil dari tanaman
dewasa, rejuvenilisasi tanaman induk melalui pemangkasan atau pemupukan
dapat membantu untuk memperoleh eksplan muda agar kultur lebih berhasil.
Ukuran eksplan juga mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan dengan
ukuran kecil lebih mudah disterilisasi dan tidak membutuhkan ruang serta
media yang banyak, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih
kecil sehingga dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan dan
regenerasinya. Sebaliknya semakin besar eksplan, maka semakin besar
kemungkinannya untuk membawa penyakit dan makin sulit untuk disterilkan,
membutuhkan ruang dan media kultur yang lebih banyak. Ukuran eskplan
yang sesuai sangat tergantung dari jenis tanaman yang dikulturkan, teknik dan
tujuan pengkulturannya.
d. Macam-macam Mikropropagasi
1) Produksi tanaman dari tunas-tunas aksilar
Produksi tanaman dengan merangsang terbentuknya tunas-tunas aksilar
merupakan teknik mikropropagasi yang paling umum dilakukan. Ada 2 (dua)
metode produksi tunas aksilar yang dilakukan yaitu kultur pucuk (shoot culture
atau shoot-tip culture) dan kultur mata tunas (satu mata tunas: single-node
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 21
culture; lebih dari satu mata tunas: multiple-node culture). Kedua teknik kultur
ini berdasarkan pada prinsip perangsangan terbentuknya atau munculnya
tunas-tunas samping dengan cara mematahkan dominasi apikal dari meristem
apikal.
2) Kultur pucuk (shoot culture atau shoot-tip culture)
Kultur pucuk (shoot culture) adalah teknik mikropropagasi yang dilakukan
dengan cara mengkulturkan eksplan yang mengandung meristem pucuk
(apikal dan lateral) dengan tujuan perangsangan dan perbanyakan tunastunas/
cabang-cabang aksilar. Tunas-tunas aksilar tersebut selanjutnya
diperbanyak melalui prosedur yang sama seperti eksplan awalnya dan
selanjutnya diakarkan dan ditumbuhkan dalam kondisi invivo.
Istilah yang digunakan untuk teknik kultur pucuk ini tergantung dari eksplan
yang digunakan. Jika eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk-pucuk
apikal (panjang ±20 mm) saja maka tekniknya disebut sebagai shoot-tip
culture, namun bila eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk apikal beserta
bagian tunas lain dibawahnya disebut sebagai shoot culture. Besar kecilnya
eksplan yang digunakan mempengaruhi keberhasilan kultur pucuk.
Semakin kecil eksplan, semakin kecil kemungkinannya untuk terkontaminasi
oleh mikroorganisme namun semakin kecil juga kemampuannya untuk
beregenerasi dan memperbanyak diri. Sebaliknya, semakin besar eksplan
yang digunakan maka semakin besar kemampuannya untuk beradaptasi
dalam kondisi invitro, namun makin besar juga kemungkinannya untuk
terkontaminasi, makin banyak kebutuhannya akan media dan makin besar
wadah/botol kultur yang diperlukan. Oleh karena itu perlu diketahui ukuran
eksplan yang sesuai untuk masing-masing varietas dan spesies tanaman.
Pertumbuhan pucuk, inisiasi dan perbanyakan tunas aksilar yang dihasilkan
umumnya dirangsang dengan cara menambahkan hormon pertumbuhan
(umumnya sitokinin) ke dalam media pertumbuhannya. Perlakuan ini dapat
merangsang pertumbuhan tunas samping dan mematahkan dominasi apikal
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 22
dari pucuk yang dikulturkan. Selain itu, dominasi apikal juga dapat dihilangkan
dengan perlakuan-perlakuan lain misalnya pemangkasan daun-daun yang
terdapat pada buku-buku tunas atau meletakkan eskpan dalam posisi
horisontal. Tunas-tunas aksilar yang dihasilkan selanjutnya digunakan sebagai
stek miniatur bagi proses perbanyakan berikutnya. Dengan teknik ini dan
disertai dengan sub kultur dapat diperoleh banyak sekali plantet dari satu
eksplan. Dengan membatasi jumlah sub kultur sampai maksimal 8􀂱10 kali
dapat diperoleh klon tanaman yang true-to-type.
3) Kultur mata tunas/Single-node atau multiple-node culture (Invitro
Layering)
Kultur mata tunas ini merupakan salah satu teknik invitro yang digunakan
untuk perbanyakan tanaman dengan merangsang munculnya tunas-tunas
aksilar dari mata tunas yang dikulturkan. Seperti halnya kultur pucuk, eksplan
yang digunakan dalam kultur mata tunas dapat berasal dari tunas lateral, tunas
samping atau bagian dari batang yang mengandung satu atau lebih mata
tunas (mengandung satu atau lebih buku). Dikenal dua teknik kultur mata
tunas yaitu eksplan yang mengandung mata tunas lebih dari satu ditanam
secara horisontal di atas medium padat (teknik invitro layering) atau tiap buku
yang mengandung satu mata tunas dipotong-potong dan ditanam secara
terpisah dalam tiap-tiap botol kultur.
Seperti halnya teknik kultur pucuk, pertumbuhan tunas-tunas aksilar juga
berdasarkan pada prinsip pematahan dominasi apikal. Oleh karena itu,
pertumbuhan tunas-tunas aksilar ini terjadi jika eksplan (mata tunas) ditanam
pada media yang mengandung sitokinin dalam konsentrasi cukup tinggi
sehingga sitokinin ini dapat menghentikan dominasi pucuk apikal dan
menyebabkan berkembangnya tunas-tunas aksilar. Tunas aksilar yang
terbentuk selanjutnya dipisah-pisahkan dan dapat langsung ditanam pada
media pengakaran sehingga diperoleh tanaman baru yang sempurna atau
digunakan kembali sebagai bahan tanam untuk perbanyakan selanjutnya.
Tunas-tunas tersebut selanjutnya diakarkan, diaklimatisasi dan selanjutnya
ditanam di lapangan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 23
4) Induksi pembentukan tunas dari meristem bunga
Meristem bunga dapat juga dirangsang untuk membentuk tunas-tunas
vegetatif dalam kondisi invitro. Eksplan yang digunakan adalah inflorescence
bunga yang belum matang (immature inflorescences) yaitu yang belum
membentuk organ-organ kelamin jantan dan betinanya. Penggunaan
infloresence yang telah dewasa akan menghasilkan pembentukan organ
bunga bukan kuncup vegetatif.
5) Inisiasi langsung tunas adventif
Tunas adventif adalah tunas yang terbentuk dari eksplan pada bagian yang
bukan merupakan tempat asal terbentuknya (bukan dari mata tunas atau
buku). Tunas-tunas adventif ini dapat terbentuk langsung dari eksplan tanpa
melalui proses terbentuknya kalus terlebih dahulu. Teknik ini merupakan salah
satu teknik mikropropagasi yang juga banyak dilakukan dan dapat
menghasilkan plantlet dalam jumlah jauh lebih banyak dari teknik terdahulu
(pembentukan tunas aksilar). Proses pembentukan tunas adventif langsung
dari jaringan eksplan seperti akar, pucuk dan bunga disebut organogenesis.
Terjadinya organogenesis dipacu oleh adanya komponen-komponen seperti
medium, komponen endogen selama eksplan mulai dikulturkan, dan senyawasenyawa
yang terbawa selama inisiasi eskplan. Selain itu organogenesis
dipacu juga oleh keberadaan zat pengatur tumbuh eksogen di dalam medium.
Sebagai contoh rasio antara auksin yang tinggi: sitokinin akan menginduksi
eksplan kearah pembentukan akar pada kalus tanaman tembakau tetapi
sebaliknya jika pemberian auksin rendah: sitokinin akan memacu kearah
tunas. Tunas dan akar terbentuk pada beberapa lapis sel tipis pada eksplan
beberapa spesies oleh adanya perbedaan konsentrasi antara auksin dan
sitokinin. Inisiasi akar dapat dipacu dengan penambahan NAA dan zeatin dan
pembentukan tunas dipacu dengan penambahan sitokinin seperti zeatin atau
benzylaminopurine tanpa penambahan auksin.
Menurut Torrey (1966 dalam Dodds dan Roberts, 1983) membuat hipotesis
bahwa organogenesis dari kalus diinisiasi dengan pembentukan kluster sel-sel
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 24
meristem (meristemoid) mampu merespon pada faktor-faktor dalam jaringan
untuk memproduksi primordium. Inisiasi pembentukan akar, tunas dan
embrioid juga dipengaruhi oleh faktor-faktor internal alamiah.
Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap rhizogenesis termasuk auksin,
karbohidrat, pencahayaan, dan fotoperiode. Pada beberapa kultur jaringan
auksin memacu pembentukan akar, sedangkan adanya auksin eksogen dapat
menghambatnya dan rhizogenesis dapat distimulasi oleh anti-auksin.
Keberhasilan pembentukan tunas adventif secara langsung ini sangat
tergantung pada bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan serta
sangat dipengaruhi oleh spesies atau varietas tanaman asal eskplan tersebut.
Pada tanaman yang responsif, hampir semua bagian tanaman (daun, akar,
batang, meristem, dll.) dapat dirangsang membentuk organ adventif, namun
pada tanaman lainnya tunas adventif ini hanya dapat terbentuk pada bagianbagian
tanaman tertentu saja seperti umbi lapis, embryo atau kecambah.
Seperti halnya teknik mikropropagasi lainnya, tunas adventif secara langsung
ini terbentuk melalui serangkaian tahap mulai inisiasi (Tahap 1). Setelah
eksplan berada pada kondisi aseptis dan tunas mulai tumbuh, eksplan dapat
langsung disubkulturkan ke media perbanyakan (atau media yang sama
dengan inisiasi: tergantung varietas) untuk memperbanyak tunas-tunas
adventif dari mata tunas adventif yang telah terbentuk pada tahap sebelumnya.
Tunas-tunas tersebut selanjutnya dipisahkan, diakarkan dan diaklimatisasi
untuk memproduksi tanaman lengkap dan utuh yang dapat tumbuh dalam
keadaan alamiah.
6) Somatik embryogenesis langsung
Embrio aseksual atau embrio somatik (somatic embryo) adalah embrio yang
terbentuk bukan dari penyatuan sel-sel gamet jantan dan betina atau dengan
kata lain embrio yang terbentuk dari jaringan vegetatif/somatik. Embrio ini
dapat terbentuk dari jaringan tanaman yang dikulturkan tanpa melalui proses
yang dikenal dengan nama somatic embryogenesis. Jika proses ini terbentuk
langsung pada eksplan tanpa melalui proses pembentukan kalus terlebih
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 25
dahulu, maka prosesnya disebut somatic embryogenesis langsung (direct
somatic embryogenesis).
7) Pembentukan organ penyimpan cadangan makanan mikro
Beberapa jenis tanaman dapat dikembangbiakan secara vegetatif dengan
menggunakan organ penyimpanan seperti tuber, rhizome, bulbus, dll. Organorgan
penyimpanan ini juga bisa dihasilkan pada tanaman-tanaman yang
memang secara alamiah memproduksi organ penyimpanan tersebut. Teknik
untuk mendapatkan organ penyimpanan ini sangat bervariasi tergantung pada
jenis jaringan yang dikulturkan. Organ penyimpanan mikro ini dapat digunakan
sebagai bibit untuk penanaman langsung di lapangan atau ditanam untuk
produksi umbi-umbi bibit.
2. TUGAS-1
a. Jelaskan ketidak berhasilan dalam menginduksi pembentukan tunas pada
kultur kalus dikotil oleh penambahan rasio sitokinin:auksin ke dalam
medium!
b. Apakah yang dimaksud dengan meristemoid? Apakah meristemoid ada
hubungannya dengan totipotensi?
c. Bagaimana prinsip kerja mikropropagasi, bagaimana perbedaannya dengan
kultur organ?
d. Dengan perbanyakan mikro secara invitro, pertumbuhan langsung apa
sajakah yang akan dihasilkan dari teknik ini?
Jawaban tugas sebaiknya dikirimkan melalui e-mail ke alamat e-mail Dosen
Anda atau dapat dimasukkan/diposting ke blogger Anda, setelah itu Anda
memberitahu Dosen yang bersangkutan dapat melalui SMS atau cara yang lain.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 26
3. TES FORMATIF-1
Soal Pilihan Ganda
Pilihlah salah satu jawaban yang Anda anggap paling benar
a. Pengertian perbanyakan mikro (mikropropagasi) secara umum adalah .....
1) Usaha menumbuhkan bagian tanaman dalam media aseptis
2) Memproduksi tanaman dalam jumlah sedikit
3) Memproduksi tanaman dalam waktu yang lama
4) Usaha menumbuhkan bagian tanaman dalam media aseptis dan
memperbanyak bagian tanaman tersebut sehingga dihasilkan tanaman
sempurna dalam jumlah banyak
b. Salah satu kondisi eksplan yang mempengaruhi keberhasilan teknik
mikropropagasi seperti tertulis di bawah ini, kecuali .....
1) Jenis eksplan
2) Bentuk eksplan
3) Ukuran eksplan
4) Fase fisiologis jaringan
c. Kelebihan menggunakan lampu TL pada ruang kultur seperti tertulis di bawah
ini, kecuali .....
1) Menghasilkan cahaya warna putih
2) Menghasilkan cahaya warna kuning
3) Tidak meningkatkan suhu ruang kultur secara drastis
4) Hemat energi
Soal Essay
Jawablah soal-soal di bawah ini dengan singkat dan jelas
a. Jelaskan 3 (tiga) cara untuk mengurangi variasi somaklonal!
b. Pohon induk atau bagian tanaman yang akan diambil sebagai eksplan perlu
diperlakukan khusus agar mikropropagasi berhasil. Jelaskan 4 (empat)
perlakuan khusus tersebut!
c. Jelaskan 3(tiga) faktor yang berpengaruh pada keberhasilan mikropropagasi!
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 27
4. UMPAN BALIK DAN TINDAK LANJUT-1
a. Bila jawaban Anda sudah mencapai 80% benar dibandingkan dengan kunci
jawaban tes formatif, Anda boleh melanjutkan ke materi berikutnya.
b. Bila jawaban Anda belum mencapai 80% benar dibandingkan dengan kunci
jawaban tes formatif, Anda harus mengulang kembali mempelajari materi
tersebut.
5. KUNCI JAWABAN TES FORMATIF-1
Soal Pilihan Ganda
a. 4)
b. 2)
c. 2)
Soal Essay
a. 3 (tiga) cara untuk mengurangi variasi somaklonal adalah:
1) membatasi jumlah sub-kultur dan perbanyakannya
2) menanam dalam medium tanpa hormon pertumbuhan untuk satu atau dua
periode sub kultur dan
3) jika memungkinkan menghindari perbanyakan melalui kultur kalus. Namun
pada beberapa jenis tanaman, terutama tanaman yang tidak bisa
diperbanyak dengan stek dan sulit dirangsang pembentukan tunas-tunas
adventifnya maka kultur kalus yang diregenerasikan melalui organogenesis
dan embryogenesis merupakan alternatif perbanyakan yang memungkinkan.
Apabila variasi somaklonal tidak dapat dihindari, perlu dilakukan pengujian
sifat-sifat tanaman yang diregenerasikan sebelum klon dijual secara
komersial
b. 4 (empat) perlakuan khusus bagi pohon induk atau bagian tanaman yang akan
diambil sebagai eksplan supaya mikropropagasi berhasil adalah:
1) Penanaman di green house atau pot untuk mengurangi sumber kontaminan
2) Pemberian lingkungan yang sesuai atau perlakuan kimia untuk meningkatkan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 28
3) kecepatan multiplikasi dalam kondisi invitro
4) Indexing atau prosedur lain untuk mengetahui adanya penyakit sistemik oleh
virus atau bakteri
5) Perangsangan pertumbuhan tunas-tunas dorman
c. 3 (tiga) faktor yang berpengaruh pada keberhasilan mikropropagasi adalah:
1. Genotif tanaman. Pengaruh genotif tanaman berhubungan dengan faktorfaktor
yang mempengaruhi pertumbuhan eksplan (kebutuhan nutrisi, ZPT,
dan lingkungan kultur)
2. Media kultur. Perbedaan komposisi media, ZPT, dan jenis media yang
digunakan akan mempengaruhi pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang
dikulturkan (komposisi media, ZPT, dan keadaan fisik media)
3. Lingkungan tumbuh (suhu, temperatur, dan cahaya). Temperatur yang
digunakan lebih tinggi dari kondisi invivo; kelembaban 80-99%; pertumbuhan
organ atau jaringan tanaman dalam kultur invitro umumnya tidak dihambat
oleh cahaya, namun pertumbuhan kalus umumnya dihambat oleh cahaya
(kualitas, kuantitas, intensitas, lama penyinaran, dan panjang gelombang).
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 29
DAFTAR PUSTAKA
1. Bhojwani, 1990. Plant Tissue Culture: Application & Limitations.
2. Bhojwani & Razdan, 1983. Plant Tissue Culture: Theory and practise.
3. Debergh & Zimmerman, 1990. Micropropagation: technology & application.
4. Evan, Sharp, Amminoto & Yamada., 1983/1984. Handbook of Plant Cell Culture
(Vols 1 􀂱 4).
5. Gleba & Sytnik, 1984. Protoplast Fusion : Genetic Engineering in Higher Plants.
6. Green, Somers, Hacket & Biesboer, 1987. Plant Tissue and Organ Culture.
7. Jalil, M., N. Khalid & RY. Othman, 2003. Plant regeneration from embryogenic
suspension cultures of Musa acuminata cv. Mas (AA). Plant Cell, Tissue
and Organ Culture 75: 209􀂱214, 2003.
8. Lee, S.W. 2003. Micropropagation of cavendish banana in Taiwan. FFTC,
Pingtung.
9. Morris, Scragg, Stafford & Fowler, 1986. Secondary Metabolism in Plant Cell
Cultures
10. Pierik, 1987. Invitro Culture of Higher Plants.
11. Reinert & Yeoman, 1983. Plant Cell & Tissue Culture: A Laboratory Manual.
12. Rodrigues, I., 2007. Low-cos tissue culture technology. Centre of Nuclear
Energy for Agriculture (CENA). San Paulo.
13. Stafford & Warren, 1990. Plant Cell & Tissue Culture.
14. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshamanan, 2002. Invitro plant breeding. The
Haworth Press, Inc. New York.
15. Thorpe, 1981. Plant Tissue Culture: Methods & Applications in Agriculture.
16. Torres, 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops.
17. Trigiano, R.N. and D.J. Gray, 2000. Plant tissue culture concepts and laboratory
exercises. 2nd edt. CRC Press. London.
18. Vasil, 1984. Cell Culture and Somatic cell Genetics of Plants.
19. Yeoman, 1986. Plant Cell Culture Technology.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 30
B. KEGIATAN BELAJAR-2
1. LEMBAR INFORMASI-2
KULTUR KALUS DAN SUSPENSI SEL
a. Kultur Kalus
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel
jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan
kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun
1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur
tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983). Secara in
vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada bekas-bekas luka akibat serangan
infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau
tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat
stress (George & Sherrington, 1984). Kalus yang diakibatkan oleh hasil dari
infeksi bakteri Agrobacterium tumefaciens disebut tumor.
Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang
diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan
dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkhim yang mempunyai ikatan yang
renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan
dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung
auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa
kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon,
mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang
abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan
embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus
tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang
tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang
demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 31
bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti
warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jinggaan.
Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkhim
jarang dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany
(1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang
homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai selsel
yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk
membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma.
Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur
kalus. Anyaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau
nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal,
primordial akar atau embrioid.
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu
penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara
alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus
untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan
(1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan
tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat
pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam
atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di
dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti
auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, ekstrak senyawa organik komplek
alamiah.
Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus,
jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:
1) Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan
garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus.
2) Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garamgaram
mineral seperti: empulur tembakau
3) Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garamgaram
mineral seperti jaringan kambium
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 32
4) Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam
mineral seperti parenkim dan xylem.
Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung
juga dari:
1) Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi
2) Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi
3) Bagian tanaman yang dipakai
4) Jenis tanaman.
Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang
berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis
tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil,
gymnospermae, pakis dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda,
hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk
dediferensiasi dan menghasilkan kalus.
Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa
pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya
sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di
tengah tetap quiscent. Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan
sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:
1) Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi
2) Keluarnya gas CO2
3) Kesediaan hara yang lebih banyak
4) Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap
5) Cahaya
Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan
berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam
histologinya seperti pembuluh tembakau, ternyata menghasilkan kalus dengan
sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang
berbeda. Begitupun pada kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa
campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 33
Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan
yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel
yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh
menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan
sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel
yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsurunsur
hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.
Sel heterogen berasal dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi
karena massa kultur yang panjang melalui sub kultur yang berkali-kali.
Perubahan yang terjadi dapat merupakan:
1) Aberasi kromosom
2) endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi
3) Amplifikasi gen, jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid
bertambah
4) Hilangnya suatu gen (deletion)
5) Mutasi gen
6) Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition).
Kecepatan perubahan-perubahan dalam kromosom ini, tergantung juga dari
macam media yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidak-stabilan
kromosom ini menyulitkan aplikasi kultur kalus untuk perbanyakan maupun
untuk produksi bahan-bahan/persenyawaan sekunder. Sebaliknya ketidakstabilan
tersebut dapat dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan invitro,
untuk memperoleh sifat-sifat baru yang menguntungkan seperti resistensi
terhadap penyakit, hilangnya morfologi yang memang tidak diinginkan seperti
duri atau warna pada bunga.
Kalus yang tumbuh secara invivo pada batang tanaman biasanya disebut
dengan tumor, ciri-ciri tumor adalah sebagai berikut:
1) Terjadi penyakit yang infeksinya melalui luka (Crown gall disease)
2) Jaringan tumor yang terjadi dapat tumbuh terus, walaupun penyebabnya
yang berupa bakteri Agrobacterium tumefacien telah dihilangkan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 34
3) Tumor ini bila ditumbuhkan pada media buatan tidak memerlukan auksin
maupun sitokinin. Ketidaktergantungan jaringan tanaman untuk tumbuh
dan terus membelah disebut habituation.
Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam media yang tetap, akan
menyebabkan terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat
terjadi karena selain terhisap untuk pertumbuhan juga karena media
menguapkan air dari masa ke masa. Kalus tersebut kecuali kehabisan unsur
hara, kalus juga mengeluarkan persenyawaan-persenyawaan hasil
metabolisme yang menghambat pertumbuhan kalus itu sendiri. Untuk menjaga
kehidupan dan perbanyakan yang berkesinambungan, kalus yang dihasilkan
perlu disubkulturkan.
Street (1969 dalam Dodds & Robert 1983) menyarankan massa sel yang
dipindahkan pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat
20-100 mg, supaya ada pertumbuhan yang cepat dalam media baru.
Subkultur sebaiknya dilakukan 28 hari sekali (4-6 minggu sekali). Namun
waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari kecepatan
pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu massa yang remah
(friable) dan kompak. Bila massa kalus remah maka pemindahan kalus cukup
dilakukan dengan menyendok kalus dengan spatula atau skapel langsung
disubkultur ke media baru. Namun bila kalus kompak mesti dipindah ke
petridish steril untuk dipotong-potong dengan skapel baru disubkultur ke media
baru. Kalus yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya tidak ikut
disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.
b. Kultur Suspensi
Penggunaan medium cair mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan
medium padat, antara lain pada medium padat kalus yang tumbuh akan
mengalami gradien difusi terhadap nutrien di dalam medium dan gas di dalam
kalus akan menyebabkan pertumbuhan dan metabolismenya mengalami
perubahan. Agar itu sendiri akan melepas senyawa kimia ke dalam medium
kultur dan kalus akan mensekresi sisa-sisa metabolisme ke dalam medium
yang dapat meracuni pertumbuhan kalus itu sendiri. Pada medium cair
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 35
keberadaan oksigen adalah terlarut dalam cairan medium, untuk
memperolehnya maka medium harus digoyang (agitatic).
Kultur suspensi sel harus digerak-gerakkan (goyang) untuk memperoleh
aerasi, untuk menggerakkan diperlukan alat penggoyang yang disebut dengan
platform (orbital) shaker (shaker yang arah goyangannya horizontal).
Kecepatan gerakan yang diperlukan dalam kultur suspensi sel untuk ukuran
Erlenmeyer 250 cm3 adalah 100-120 rpm. Isi medium dalam botol kultur yang
optimum adalah 20% dari volume botol kultur (Dodds & Robert, 1983).
Eksplan yang diperlukan dalam kultur suspensi sel biasanya berupa kalus
remah yang belum terdiferensiasi. Pembelahan sel akan terjadi secara
bertahap dan sel anakannya akan bebas terlepas dari sel induknya karena
adanya goyangan dari medium kultur, sehingga dalam kultur akan ditemukan
sel tunggal, agregat selular (kluster sel) dalam berbagai ukuran, residu
inokulum, dan sel-sel kultur yang mati. Kultur suspensi sel yang baik
kualitasnya bila di dalam kultur tersebut sebagian besar berisi sel tunggal dan
kluster sel yang berukuran kecil-kecil. Keadaan seperti ini dapat dikatakan
kalus di dalam kultur bersifat remah. Kalus yang remah pada beberapa jenis
eksplan dapat distimulasi dengan formula ZPT konsentrasi auksin yang lebih
tinggi dibandingkan sitokinin, tetapi untuk jenis eksplan yang lain dapat saja
menghambat terbentuknya kalus yang remah. Tidak ada prosedur standar
yang baku untuk memproduksi kalus remah, jadi harus dilakukan coba-coba
untuk jenis eksplan yang berbeda-beda (Dodds & Robert, 1983).
c. Suspensi Sel untuk Memproduksi Senyawa Metabolik Sekunder
Kultur suspensi biasanya dimulai dari mengsubkultur potongan kalus ke media
cair, kecuali itu kultur suspensi juga dapat menggunakan potongan organ
(seperti hipokotil, kotiledon dan lain-lain) sebagai ekplan hanya saja teknik ini
memerlukan waktu yang lebih lama. Pembelahan sel secara bertahap akan
terlepas dari sel induk bebas bergerak di dalam inokulum karena adanya
gerakan dari medium. Setelah beberapa saat kultur akan tersusun atas sel
tunggal, kumpulan sel (agregate cellular) dengan ukuran yang bervariasi, sisa
potongan eksplan dan sisa-sisa sel mati. Dalam kultur kalus dan suspensi sel
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 36
dikenal istilah friabel yang maksudnya adalah sel-sel terpisah setelah
mengalami pembelahan sel. Bentuk suspensi sel yang bagus adalah kultur
yang persentasi kandungan sel tunggal dan kumpulan sel-sel kecilnya tinggi.
Derajat pemisahan sel pada kultur telah dicirikan adanya sifat friabilitas dari sel
tersebut, sifat tersebut dapat dimunculkan atau diinduksi dengan merubah
komposisi unsur hara media. Seperti pada penambahan auksin dari pada
sitokinin pada beberapa masalah dapat memacu produksi sel yang friabel.
Namun sebaliknya ada beberapa kultur malah menjadi terhambat proses
friabilitasnya. Jadi tidak ada prosedur standar yang dapat direkomendasikan
untuk memulai kultur suspensi sel dari kalus, maka untuk memilih kondisi
yang sesuai harus melakukan coba-coba (trial and error) (Dodds & Robert,
1982).
Untuk mengkultur kalus ke kultur suspensi, pertama kali dibutuhkan kalus
seberat 2-3 g per 100 cm3. Pertumbuhan jumlah sel akan mengikuti
pertambahan eksponensial dan linier dalam populasi sel. Lama-lama
kecepatan pembelahan sel akan melambat dan akhirnya akan mencapai fase
diam atau stationary. Agar sel tetap dapat tumbuh maka pada awal fase diam
sel-sel harus disubkultur pada media yang baru. Setiap jenis tanaman akan
mempunyai panjang waktu fase pertumbuhan dan fase diam yang berbedabeda.
Pada kebanyakan kultur suspensi kerapatan optimum akan tercapai
pada umur 18-25 hari setelah tanam dan fase sel paling aktif pada umur 6-9
hari setelah tanam.
Tanaman merupakan sumber bahan makanan bagi manusia, juga merupakan
sumber berbagai macam bahan kimia seperti:
1) Bahan obat-obatan ($ 8 milyar, 1989)
2) Enzim
3) Minyak dan lemak
4) Agrokimia (insektisida, herbisida)
5) Karet
6) Penyedap makanan (aroma, warna, rasa)
7) Bahan kontrasepsi
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 37
8) Pemanis alam, zat pewarna
9) Pengharum (minyak wangi).
Sebagian besar bahan kimia di atas (kecuali enzim) adalah merupakan
senyawa metabolik sekunder yaitu senyawa yang diproduksi oleh tanaman
tetapi tidak memiliki fungsi vital bagi metabolisme tanaman tersebut. Tujuan
produksi senyawa metabolik sekunder ini bagi tanaman antara lain:
1) Mengusir predator
2) Menyerang pollinator
3) Melawan penyakit-penyakit infeksi.
Senyawa metabolik sekunder tersebut bermanfaat bagi manusia dan dapat
dimanfaatkan untuk tujuan konsumsi, pengobatan, industri obat tradisional dan
modern, industri agrokimia berupa pestisida dan insektisida, industri farmasi
dan kosmetika dan lain-lain. Ekstraksi senyawa metabolik sekunder
sebelumnya hanya dilakukan langsung dari bagian tanaman tersebut melalui
budidaya maupun eksploitasi organ tanaman dan tumbuhan liar yang
menghasilkan senyawa metabolik sekunder tersebut. Selain produksi dan
ekstraksi langsung dari organ tanaman, senyawa metabolik sekunder yang
diproduksi oleh jaringan tanaman dapat juga diproduksi secara invitro dalam
kondisi kultur yang mendukung (Verpoorte dkk. 1999, Adnane dkk. 2001,
Kazufumi dkk. 2001). Tujuan produksi senyawa metabolik sekunder dalam
kultur jaringan adalah untuk mendapatkan sel, kalus atau embrio somatik yang
dapat memproduksi senyawa kimia tersebut dalam jumlah besar untuk
kemudian mengekstrak senyawa kimia penting tersebut. Produksi senyawa
metabolik sekunder secara invitro menggunakan bioreaktor pada kultur sel
secara besar-besaran merupakan salah satu cara yang digunakan oleh
beberapa perusahaan industri untuk memproduksi beberapa senyawa kimia
secara komersial (Verpoorate dkk. 1999).
Produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan ini memiliki
beberapa kelebihan dan kekurangan. Keuntungan produksinya melalui kultur
jaringan dibandingkan dengan ekstraksi dari organ tanaman dan
penanamannya di lapangan antara lain:
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 38
1) Produksinya tidak tergantung pada lingkungan terutama musim sehingga
produksinya bisa dilakukan setiap saat yang dapat menjamin kontinuitas
produksi, kuantitas dan kualitasnya
2) Produksi senyawa metabolik sekunder melalui kultur jaringan tidak
membutuhkan tempat yang luas. Untuk produksi skala besar dapat
dilakukan dalam suatu laboratorium dengan menggunakan bioreaktor.
Meskipun memiliki kelebihan di atas, teknik ini membutuhkan ketrampilan dan
alat khusus dalam melakukannya. Untuk itu perlu mengetahui terlebih dahulu
pengetahuan tentang:
1) Perkembangan Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur
Jaringan
2) Prosedur Produksi Senyawa Metabolik Senyawa metabolik Melalui Kultur
Jaringan
3) Teknik Peningkatan Produksi Metabolik Sekunder Melalui Kultur Jaringan.
1) Perkembangan Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur
Jaringan
Sampai saat ini masih sedikit senyawa metabolik sekunder yang telah
diproduksi melalui kultur jaringan secara komersial. Beberapa jenis senyawa
metabolik sekunder yang telah diproduksi secara komersial melalui kultur
jaringan adalah:
a) Produksi Shikonin yaitu suatu senyawa napthaquinon yang digunakan
sebagai bahan perwarna dan bahan obat-obatan telah diproduksi dalam
skala komersial oleh Mitsui Petrochemical Co. Shikonin ini tergolong
mahal dengan harga mencapai $ 5.000 per kilogram . Shikonin ini
diproduksi dari Lithospermum erythrorhizon.
b) Produksi nikotin dalam konsentrasi tinggi dari beberapa kalus Nicotiana
c) Produksi berberin dari Coptis japonica. coumarin dari Cichorium intybus
L. cv. Lucknow (Hendaryono dan Wijayani 1999 1999, Adnane dkk. 2001,
Bais dkk. 2001, Kazufumi 2001).
Sedikitnya senyawa metabolik sekunder yang telah diproduksi secara
komersial antara lain disebabkan oleh masih rendahnya kuantitas produksi
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 39
senyawa tersebut dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, tujuan produksinya
melalui kultur jaringan adalah untuk memproduksi sel, kalus atau embrio
somatik yang dapat memproduksi senyawa metabolik sekunder dalam
kuantitas dan kualitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan produksinya
pada tumbuhan sehingga teknik ini dapat mendatangkan keuntungan secara
ekonomi. Beberapa contoh perbandingan produksi senyawa metabolik
sekunder melalui kultur jaringan dengan isolasinya di daun antara lain:
a) Kultur kalus Lithospermum dapat memproduksi 27% dari Ginsengoside
dari berat basah kalus sedangkan isolasinya dari tanaman hanya mampu
memproduksi 5% Lithospermum.
b) Kultur sel dari daun tembakau dapat memproduksi 3􀂱4% nikotin
dibandingkan dengan isolasinya dari daun tanaman sebesar 2,5%
c) Kultur kalus ginseng hanya mampu memproduksi 0,4% ginsenisida
padahal isolasi dari tanaman dapat menghasilkan 0,3-3% ginsenisida
d) Kultur sel baru dapat memproduksi 0,5% ubiquinone padahal isolasi dari
daun dapat menghasilkan sampai 16% ubiquinone.
Berikut dikemukakan beberapa jenis senyawa metabolik sekunder yang
produksinya telah dicoba melalui kultur jaringan beserta asal tanaman dan
penggunaannya.
Tabel 1. Kandungan Senyawa Kimia pada Berbagai Marga Tanaman dan
Manfaatnya
No SENYAWA KIMIA MARGA (GENUS) PENGGUNAAN
1 Quinine Chichona Anti malaria
2 Taxol Taxus Anti tumor
3 Morphine Papaver Penghilang rasa sakit
4 Saponin Panax Sirkulasi darah
5 Vanillin Vanilla Flavour/penyedap
6 Caffeine Coffee Flavour/penyedap/stimulan
7 Nicotine Nicotiana Stimulan
8 Cocaine Erythoxien Hallucinogen
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 40
2) Prosedur Produksi Senyawa Metabolik Sekunder Melalui Kultur
Jaringan
Seperti teknik kultur jaringan lainnya, produksi senyawa metabolik sekunder
secara invitro juga dilakukan melalui serangkaian tahapan. Di depan telah
dijelaskan bahwa tujuan dari kultur ini adalah untuk mendapatkan kalus, sel
atau embrio somatik dalam tahapan pertumbuhan tertentu dimana pada saat
tersebut diproduksi dan dapat diekstraksi senyawa metabolik sekunder dalam
kuantitas dan kualitas yang memadai. Oleh karena itu, 2 (dua) prosedur dasar
teknik ini diarahkan pada produksi kalus, sel atau somatik embrio kemudian
optimasi kondisi kultur kalus, sel atau somatik embrio untuk produksi senyawa
metabolik sekunder dalam kuantitas dan kualitas yang tinggi. Tahapan invitro
ini disertai dengan ekstraksi secara berkala terhadap senyawa metabolik
sekunder yang dihasilkan. Untuk dapat menghasilkan senyawa metabolik
sekunder, prosedurnya adalah sebagai berikut:
a) Pemilihan eksplan dan sterilisasi
Pada umumnya semua jenis eksplan dapat digunakan untuk produksi
senyawa metabolik sekunder. Bohm (1980) menyatakan bahwa pada
umumnya senyawa metabolik sekunder yang diproduksi oleh organ
tanaman yang berbeda umumnya sama meskipun pada kondisi alamiah
senyawa yang dihasilkan oleh masing-masing organ tersebut berbeda.
Meskipun demikian, produksi yang optimal sangat tergantung pada jenis
eksplan yang digunakan. Optimasi jenis dan kondisi eksplan merupakan
tahapan awal dalam produksi senyawa metabolik sekunder. Optimasi ini
dibarengi dengan optimasi teknik sterilisasi eksplan. Sterilisasi eksplan dari
organ atau jaringan tanaman yang diambil dari tanaman di lapangan dapat
dilakukan secara kimia misalnya dengan sodium hypochorite pada
konsentrasi 1􀂱2% (v/v).
Pada beberapa jenis eksplan, sterilisasi dapat dilakukan dengan cara
pembakaran (misalnya untuk eksplan berupa endosperm atau embrio).
Salah satu eksplan yang termasuk sulit disterilisasi adalah eksplan dari
akar atau bagian tanaman lain yang diambil dari dalam tanah (misalnya
tuber). Sterilisasi untuk eksplan ini dapat dilakukan dengan menggunakan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 41
mercuri chloride, akan tetapi karena senyawa ini berbahaya bagi manusia
maka akar umumnya diisolasi dari akar steril yang ditumbuhkan secara
invitro dengan teknik kultur embrio atau kultur akar.
b) Inisiasi dan proliferasi kalus
Inisisasi kalus dilakukan pada berbagai jenis media. Kalus umumnya
diinisiasi pada media padat. Umumnya ke dalam media ditambahkan
hormon tanaman (Plant Hormon) yang sesuai untuk pertumbuhan dan
proliferasi kalus. Hormon tersebut umumnya adalah 2,4-D atau campuran
auksin dan sitokinin dalam proporsi yang seimbang. Proliferasi kalus dapat
dilakukan pada media dengan konsentrasi hormon yang sama. Proliferasi
ini ditujukan untuk memperoleh kalus dalam jumlah yang memadai.
c) Seleksi kalus yang berproduksi tinggi
Umumnya kalus dapat memproduksi senyawa metabolik sekunder setelah
beberapa lama dalam kultur. Meskipun demikian, produktivitas dari kalus
tersebut sangat tergantung pada tahapan pertumbuhannya. Saat produksi
dan jumlah senyawa metabolik sekunder yang dihasilkan oleh masingmasing
kalus tersebut berbeda tergantung dari tingkat pertumbuhan kalus
dan kondisi kulturnya. Umumnya produksi senyawa metabolik sekunder
yang tinggi terjadi pada saat kalus sedang dalam pertumbuhan maksimal
yang diperoleh saat pertumbuhan linier. Oleh karena itu dalam proses
produksi senyawa metabolik sekunder dari kalus, sangat penting untuk
mengetahui tahapan pertumbuhan kalus ini. Hal ini dapat dilakukan dengan
pengamatan terhadap pertumbuhannya kemudian membuat grafik
pertumbuhan kalus. Lini kalus yang berproduksi tinggi tersebut kemudian
diseleksi untuk kemudian dikulturkan dalam bentuk kultur agregat sel, kultur
sel atau diregenerasikan menjadi embrio.
d) Inisiasi kultur sel, agregat sel atau embrio somatik dan senyawa
metabolik sekunder
Senyawa metabolik sekunder umumnya diekstraksi dari kultur agregat sel,
kultur sel dan sel suspensi atau kultur embrio somatik. Lini kalus yang
terpilih kemudian disubkulturkan ke media untuk produksi senyawa
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 42
metabolik sekunder. Pada media ini, konsentrasi hormon tanaman yang
ditambahkan umumnya sama atau lebih rendah dengan kondisi untuk
proliferasi kalus.
Produksi senyawa metabolik sekunder dapat dilakukan pada media padat
atau media cair. Senyawa metabolik sekunder dapat diekstraksi langsung
dari kalus atau dari media. Hal ini menyebabkan produksinya pada media
padat kurang optimal karena pada media padat eksudat tersebut sering kali
terkumpul pada media di sekitar eksplan sehingga meracuni kalus. Untuk
mengatasi hal ini dilakukan produksi pada media cair. Lini kalus terpilih di
subkulturkan ke media cair. Kumpulan kalus dalam kultur cair ini disebut
sebagai kultur agregat sel, selain dalam bentuk kelompok, kalus ini dapat
digunakan untuk produksi kultur sel yang kemudian dicairkan membentuk
kultur sel suspensi. Kultur ini umumnya diletakkan di atas alat penggojok
(shaker) untuk menjamin suplai oksigen ke eksplan. Senyawa yang
diproduksi oleh kultur cair ini ada yang harus diekstrak dari sel dan
sebagian disekresikan ke media. Apabila hasil sekresi ini terakumulasi di
dalam media, senyawa metabolik bisa beracun bagi pertumbuhan sel
selanjutnya dan dapat menyebabkan kultur mati atau tumbuh sub optimal.
Oleh karena itu perlu dilakukan subkultur atau ekstraksi senyawa metabolik
sekunder secara berkala.
Selain ekstrasksi dari kultur kalus, kultur sel dan suspensi, beberapa jenis
senyawa metabolik sekunder diproduksi secara optimum dari kalus atau sel
yang telah berdiferensiasi menjadi embryo, baik dalam kultur dalam kultur
padat maupun cair (suspensi).
Pada produksi skala besar telah dikembangkan bioreaktor. Bioreaktor
memiliki volume besar, lebih dari 1 liter media dengan lebih dari 60.000
embryo/kelompok sel. Bioreaktor yang ditempatkan secara paralel
memungkinkan perkembangan sel menjadi embrio dalam satu unit atau
beberapa reaktor. Umumnya sel ditanam dalam media cair dengan
pengadukan. Pengadukan bisa dilakukan secara mekanis (misalnya
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 43
dengan penggojokan, penggunaan alat pengaduk) atau dengan
memasukkan udara steril (gerakan udara) ke dalam bioreaktor.
e) Ekstraksi dan pemurnian senyawa metabolik sekunder
Ekstraksi dapat dilakukan dari kalus, sel atau embrio somatik serta dari
media. Ekstraksi dari media umumnya dilakukan secara berkala dengan
interval waktu 2 hari sekali. Media yang mengandung senyawa metabolik
sekunder diambil secara aseptis dari kultur bersamaan dengan
penambahan media baru ke dalam kultur. Pada saat produksi senyawa
metabolik sekunder dari kalus, sel dan embrio somatik ini mulai menurun,
kalus, sel dan embrio somatik ini dikeluarkan dari kultur atau bioreaktor dan
diganti dengan kalus, sel dan embrio baru. Senyawa metabolik sekunder
dari kalus, sel dan embrio baru diekstraksi dengan menggunakan bahan
pengekstrak, seperti alkohol (misalnya methanol) atau DCM. Ekstraksi dari
kalus dilakukan setelah kalus dikeringkan.
3) Teknik Peningkatan Produksi Metabolik Sekunder Melalui Kultur
Jaringan
Berbagai macam faktor mempengaruhi keberhasilan produksi senyawa
metabolik sekunder yang dihasilkan. Selain itu, beberapa faktor juga
menentukan kuantitas dan kualitas senyawa metabolik sekunder yang
dihasilkan.
Pada prinsipnya setiap sel memiliki kemampuan untuk memproduksi
senyawa metabolik sekunder yang diproduksi oleh tanaman. Oleh karena itu,
berbagai macam eksplan baik berupa organ dan jaringan dari daun, batang,
akar, bunga dan buah dapat digunakan sebagai eksplan. Akan tetapi, pada
setiap jenis tanaman terdapat bagian organ tertentu yang dapat
memproduksi senyawa metabolik sekunder yang diinginkan dalam kuantitas
dan kualitas yang memadai. Produksi diterpane glycosida yang optimal
diperoleh dari kultur daun Nicotiana attenuata (Keinanen dkk. 2001), dan
produksi shikonin juga diperoleh dari kultur akar Lithospermum erythrorhizon
(Kazufumi 2001).
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 44
Selain jenis eksplan, perbedaan kondisi kultur juga mempengaruhi kualitas
dan kuantitas senyawa metabolik sekunder yang dihasilkan Bohm (1980),
Verpoorte et.al. (1999), Adnane et.al., (2001), Kazufumi et.al. (2001) Bohm
(1977) dalam Bohm (1980), menyatakan bahwa cahaya dan auksin
merupakan dua faktor yang sangat mempengaruhi produksi flavonoid dan
pigmen lainnya dalam kultur. Kultur sel dan sel suspensi yang ditanam dalam
kondisi terang (dengan pencahayaan) memproduksi enzim yang berperan
dalam biosintesis flavonoid, sehingga produksi flavonoid pada sel tersebut
meningkat.
Selain hal tersebut di atas, komposisi (unsur hara dan hormon pertumbuhan)
serta kondisi fisik media juga ikut menentukan kuantitas dan kualitas
senyawa metabolik sekunder yang dihasilkan seperti telah disampaikan
sebelumnya.
Dengan memahami faktor-faktor yang mempengaruhi kuantitas dan kualitas
metabolik sekunder yang diproduksi tersebut, optimasi produksi metabolik
sekunder dapat dilakukan, antara lain dengan:
a) Immobilisasi
Pertumbuhan agregat kalus, sel, dan embrio meningkat pada kultur cair,
demikian juga produksi senyawa metabolik sekunder. Pada kultur cair,
sintesa dan ekstraksi metabolik sekunder dapat dilakukan secara
maksimum tanpa mengganggu perttumbuhan sel atau embrio. Hal ini
dapat dilakukan dengan meletakkan sel pada gel, busa polyurethin, jaring
nylon dan serat sehingga pada saat diekstrak, sel melekat pada gel, busa
polyurethin, jaring nylon dan serat tersebut dan tidak ikut keluar bersama
medianya.
b) Biotransformasi
Transformasi sel dapat dilakukan secara biologi sehingga dapat
dihasilkan senyawa metabolik sekunder yang diharapkan. Salah satu
contohnya adalah penggunaan enzim yang terdapat dalam sel tanaman
untuk menghasilkan struktur kimia dari senyawa kimia lain yang
diletakkan dalam media kultur.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 45
c) Penggunaan Elicitor
Ragi dapat digunakan sebagai elicitor yang meningkatkan produksi
senyawa metabolik sekunder dalam kultur jaringan.
2. TUGAS-2
a. Mengapa jaringan yang mengandung kambium sangat bagus digunakan
sebagai eksplan untuk menginduksi kalus?
b. Mengapa kalus akan mengalami nekrosis apabila dibiarkan tumbuh berlamalama
dalam satu medium tanpa disubkultur ke medium yang baru?
c. Mengapa dalam kultur kalus akan diperoleh jenis sel yang bervariasi? Dan
mengapa pula tanaman yang diperoleh dari kultur kalus sering bervariasi?
d. Apa keunggulan dan kelemahan kultur jaringan tanaman medium cair dan
medium padat?
e. Apa kegunaan dari kultur suspensi sel?
f. Bagaimana cara memproduksi metabolik sekunder dan bagaimana cara
mengambil alkaloid yang telah diproduksi oleh sel-sel di dalam kultur suspensi
tersebut?
Jawaban tugas sebaiknya dikirimkan melalui e-mail ke alamat e-mail Dosen Anda
atau dapat dimasukkan/diposting ke blogger Anda, setelah itu Anda memberitahu
Dosen yang bersangkutan dapat melalui SMS atau cara yang lain.
3. TES FORMATIF-2
Soal Pilihan Ganda
Pilihlah jawaban yang Anda anggap paling benar
a. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan
oleh .....
1) Doods dan Roberts
2) Sinnot
3) George dan Sherington
4) Narayanaswany
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 46
b. Eksplan yang diperlukan dalam kultur suspensi sel biasanya berupa .....
1) Kalus
2) Tunas
3) Kalus remah yang belum terdiferensiasi
4) Kalus remah yang sudah terdiferensiasi
c. Tujuan produksi senyawa metabolit sekunder bagi tanaman seperti tertulis di
bawah ini, kecuali .....
1) Mengusir mikroorganisme
2) Mengusir predator
3) Menyerang pollinator
4) Melawan penyakit-penyakit infeksi
Soal Essay
Jawablah soal-soal di bawah ini dengan jelas dan singkat
a. Pada umumnya kemampuan pembentukan kalus dari jaringan tergantung pada
4 (empat) faktor. Tuliskan 4 (empat) faktor tersebut!
b. Tanaman merupakan sumber bahan makanan bagi manusia dan sumber
berbagai macam bahan kimia. Tuliskan 9 (sembilan) macam bahwa tanaman
sebagai sumber bahan kimia!
c. Jelaskan 3 (cara) yang dapat dilakukan untuk mengoptimasi produksi metabolik
sekunder!
4. UMPAN BALIK DAN TINDAK LANJUT-2
a. Bila jawaban Anda sudah mencapai 80% benar dibandingkan dengan kunci
jawaban tes formatif, Anda boleh melanjutkan ke materi berikutnya.
b. Bila jawaban Anda belum mencapai 80% benar dibandingkan dengan kunci
jawaban tes formatif, Anda harus mengulang kembali mempelajari materi
tersebut.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 47
5. KUNCI JAWABAN TES FORMATIF-2
Soal Pilihan Ganda
a. 2)
b. 3)
c. 1)
Soal Essay
a. 4 (empat) faktor kemampuan pembentukan kalus dari jaringan adalah
1) Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi
2) Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi
3) Bagian tanaman yang dipakai
4) Jenis tanaman
b. 9 (sembilan) macam tanaman sebagai sumber bahan kimia adalah
1) Bahan obat-obatan ($ 8 milyar, 1989)
2) Enzyme
3) Minyak dan lemak
4) Agrokimia (insektisida, herbisida)
5) Karet
6) Penyedap makanan (aroma, warna, rasa)
7) Bahan kontrasepsi
8) Pemanis alam, zat pewarna
9) Pengharum (minyak wangi)
c. 3 (tiga) cara yang dapat dilakukan untuk mengoptimasi produksi metabolik
sekunder adalah
a) Immobilisasi
Pertumbuhan agregat kalus, sel, dan embrio meningkat pada kultur cair,
demikian juga produksi senyawa metabolik sekunder. Pada kultur cair,
sintesa dan ekstraksi metabolik sekunder dapat dilakukan secara maksimum
tanpa mengganggu perttumbuhan sel atau embrio. Hal ini dapat dilakukan
dengan meletakkan sel pada gel, busa polyurethin, jaring nylon dan serat
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 48
sehingga pada saat diekstrak, sel melekat pada gel, busa polyurethin, jaring
nylon dan serat tersebut dan tidak ikut keluar bersama medianya.
b) Biotransformasi
Transformasi sel dapat dilakukan secara biologi sehingga dapat dihasilkan
senyawa metabolik sekunder yang diharapkan. Salah satu contohnya adalah
penggunaan enzym yang terdapat dalam sel tanaman untuk menghasilkan
struktur kimia dari senyawa kimia lain yang diletakkan dalam media kultur.
c) Penggunaan Elicitor
Ragi dapat digunakan sebagai elicitor yang meningkatkan produksi senyawa
metabolik sekunder dalam kultur jaringan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 49
DAFTAR PUSTAKA
1. Adnane H, Huguette S, Chantal B, 2001. Effects of plant growth regulators on
the growth and pyrethrin production by cell cultures of Chrysanthemum
cinerariaefolium. Australian-Journal-of-Botany. 49 (1): 81-88.
2. Bais HP, Sudha G, George J and Ravishankar GA, 2001. Influence of
exogenous hormones on growth and secondary metabolite production in
hairy root cultures of Cichorium intybus L. cv. Lucknow Local. Invitro
Cellular and Developmental Biology Plant 37 (2): 293-299.
3. Bohm H., 1980. The formation of secondary metabolites in plant tissue and cell
cultures. In: Vasil I.K. (Ed): International Review of Cytology :
Perspectives in Plant Cell and Tissue Culture. Academic Press Inc.,
Yew Yok. pp. 183 􀂱 208.
4. Chawla, H.S. 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd Edt. Science
Publishers, Inc. New Hampshire.
5. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge
University Press. London. 178 p.
6. George E.F. and P.D. Sherington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture:
Handbook and Directory for Commercial Laboratories. Exegetics,
England. 709 p.
7. George E.F., 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: The Technology.
Exegetics, England. 574 p.
8. Kazufumi Y, 2001. Root-specific production of secondary metabolites:
Regulation of shikonin biosynthesis by light in Lithospermum
erythrorhizon. Natural Medicines 55 (2): 49-54.
9. Keinanen M, Oldham NJ, Baldwin IT, 2001. Rapid HPLC screening of
jasmonate-induced increases in tobacco alkaloids, phenolics, and
diterpene glycosides in Nicotiana attenuata. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 49 (8): 3553-3558.
10. Kyong KH, Ryang OS, Kyu LH dan Hoon H, 2001. Benzothiadiazole enhances
the elicitation of rosmarinic acid production in a suspension culture of
Agastache rugosa O. Kuntze. Biotechnology Letters. 23 (1): 55-60.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 50
11. Majada JP, Sierra MI dan Sanchez TR, 2000. One step more towards taxane
production through enhanced Taxus propagation. Plant Cell Reports 19
(8): 825-830.
12. Nikmatullah A., Karwati Z. dan IGMA Parwata, 2003. Studi Produksi Senyawa
Metabolik Sekunder Secara Invitro Pada Kalus Makuto Dewo
(Phelearia papuana L.).1 Laporan Penelitian, Universitas Mataram. 30
h.
13. Roman K, Marketa S dan Jan V (2001). Gas-chromatographic determination of
S-methylcysteine sulfoxide in cruciferous vegetables.European Food
Research and Technology 213 (4-5): 386-388.
14. Roman K, Marketa S, Jan V, 1999. Gas chromatographic determination of Salk(
en)ylcysteine sulfoxides. Journal of Chromatography 862 (1): 85-94.
15. Verpoorte R, Heijden VR, Hoopen HJG, Memelink J, 1999. Metabolic
engineering of plant secondary metabolite pathways for the production
of fine chemicals. Biotechnology Letters 21 (6): 467-479.
16. Verpoorte R, Heijden VR, Memelink J, 2000. Engineering the plant cell factory
for secondary metabolite production. Transgenic Research 9 (4-5): 323-
343.
17. Wagner H., S. Baht, E.M. Zgainski, 1983. Plant Drug Analysis. Springer-Verlag,
Berlin, New York.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 51
C. KEGIATAN BELAJAR-3
a) LEMBAR INFORMASI-3
PRODUKSI TANAMAN HAPLOID
a. Kegunaan Haploid dalam Pemuliaan Tanaman
Tanaman haploid adalah tanaman yang mempunyai jumlah kromosom sama
dengan gametofitik dalam sporofitik (Bajaj, 1983). Frekuensi terjadinya
haploid spontan di alam masih sangat rendah, yakni sekitar 0,001-0,01%.
Produksi haploid yang spontan biasanya terjadi melalui proses partenokarpi
dari telur yang tidak dibuahi atau apomiksis.
Dalam percobaan-percobaan terdahulu, haploid diperoleh melalui:
1) Hibridisasi jenis tanaman yang berada (distant hybridization)
2) Polinasi tertunda (delayed pollination)
3) Penggunaan polen yang sudah diradiasi
4) Perlakuan hormon
5) Shock dengan temperatur tinggi.
Haploid pada tanaman dapat digolongkan menjadi 2 golongan yaitu:
1) Monoploid: jumlah kromosom setengah dari kromosom spesies yang
diploid
2) Polihaploid: jumlah kromosom setengah dari kromosom spesies yang
poliploid
Tanaman haploid dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi dan rekombian
yang unik. Mutasi yang resesif tidak muncul dalam keadaan diploid.
Contohnya pollen dari hibrida antara MC-160 dan Coker-139 yang
ditumbuhkan dihasilkan lini-lini tanaman baru yang menunjukkan resistensi
terhadap penyakit layu bakteri dan Black Shank yang lebih tinggi. Lini baru ini
tidak kehilangan sifat unggul MC-1610 (Gunawan, 1988).
Penggandaan jumlah kromosom akan diperoleh tanaman homozigot.
Tanaman homozigot sangat penting untuk menghasilkan hibrida terkendali.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 52
b. Teknik Mendapatkan Tanaman Haploid Secara Invitro
1) Kultur anther
Keuntungan: teknik isolasinya lebih mudah, dapat menghasilkan tanaman
dengan jumlah kromosom yang bervariasi (n, 2n dan 3n).
Kerugian : T anaman yang diperoleh bermacam-macam karena
kemungkinan tanaman tersebut berasal dari jaringan lain
seperti jaringan tapetum (3n), atau jaringan penyambung
(conective tissue), sehingga masih perlu tahapan seleksi.
2) Kultur polen
Keuntungan:
a) Kepastian haploid yang lebih tinggi
b) Perkembangan androgenesis dapat diikuti
c) Studi tranformasi dan mutagenesis, baik kimia maupun fisik, mudah
dilakukan karena polen terdiri dari sel tunggal
Kerugian: Keberhasilan masih rendah
3) Kultur ovul/bakal buah (ovule culture)
1) Kultur anther
Keberhasilan kultur anther telah diwujudkan pada tanaman seperti
nicotiana tabacum, karet, poplar, dan, tanaman Gramineae. Teknik kultur
anther relatif sederhana dan efisien yang paling penting adalah kritis
dalam penentuan tingkat perkembangan pollen (androgenesis) yang tepat
pada anther yang akan dijadikan eksplan.
Secara praktis tingkat perkembangan pollen dapat ditentukan
berdasarkan pengambilan contoh beberapa tingkat perkembangan
kuncup bunga. Tingkat perkembangan androgenesis pollen uninucleat
paling sesuai bila digunakan sebagai eksplan.
Media dasar yang digunakan untuk tanaman dikotil, umumnya adalah
media MS, media White dan media Nitsch &Nitsch, dengan berbagai
modifikasi dengan penambahan sukrosa sekitar 20-40 gram/liter. Zat
Pengatur Tumbuh diberikan dalam konsentrasi serendah mungkin untuk
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 53
menghindari terbentuknya kalus dari jaringan-jaringan diploid yang tidak
diinginkan. Untuk mendapatkan double haploid dipergunakan larutan
colchicine: 0,5% dengan waktu perendaman 24-28 jam.
Tanaman monokotil terutama tanaman Gramineae seperti padi, media
MS juga dapat digunakan. Tetapi selain MS, dikembangkan juga
beberapa media lain misalnya media N6. Media N6 mempunyai ciri
perbandingan NH4
+ dan NO3
_ yang jauh perbedaannya. Ammonium yang
diberikan dalam bentuk (NH4)2SO4 hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan
KNO3: 2830 mg/l. Khusus untuk padi, ada beberapa media lain yang
dikembangkan di Cina, sesuai dengan kultivar padinya, misalnya media
SK3, He5 dan LB.
Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan produksi haploid melaui
kultur invitro adalah:
a) Tingkat Perkembangan Pollen
Pada tanaman padi, frekuensi pembentukan kalus yang tertinggi
diperoleh pada kultur anther dengan pollen yang nukleusnya terletak
di pinggir sel (mid-uninucleate microspore stage). Pembentukan
terbentuknya kalus pada berbagai stage adalah sebagai berikut:
§ 5,6% kultur membentuk kalus pada early-uninucleate stage, yaitu
sesudah tetrad terbentuk
§ 35,7% kultur membentuk kalus pada mid-uninucleate stage
§ 10,5% pada saat late-uninucleate stage
§ 6,7% pada saat mitosis pertama dari pollen
§ 0% pada saat polen mencapai bi-nucleat stage.
b) Perlakuan fisik sebelum inokulasi
Perlakuan temperatur rendah sebelum inokulasi, meningkatkan
keberhasilan kultur anther dalam: Nicotiana tabacum, Hordeum
vulgare dan Oryza sativa. Pada umumnya, temperatur antara 3-10oC.
Bila dipergunakan temperatur rendah 3-5oC, maka waktu perlakuan
dapat dipersingkat, sedangkan pada temperatur rendah 10-15oC,
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 54
waktu perlakuan lebih panjang. Percobaan Wang dan grupnya (Chen,
1986) dalam kultur padi hsien menunjukkan:
§ Bila temperatur 3-5oC, dibutuhkan 10 hari.
§ Bila temperatur 6-8oC, dibutuhkan 15 hari.
§ Bila temperatur 9-10oC, dibutuhkan 20 hari.
c) Perlakuan kimia sebelum inokulasi
Anther yang dikultur dalam media cair yang ditambah dengan 50-250
mg/l colchisine selama 4 hari, meningkatkan frekuensi pembentukkan
kalus dan diferensiasi. Colchicine dapat meningkatkan tanaman
double haploid hingga 79%, sedangkan anher tanpa perlakuan
pendahuluan, hanya menghasilkan 53,8% tanaman. Jika konsentrasi
colchicine ditingkatkan hingga 500 mg/l akan mengakibatkan frekuesi
tanaman anakan yang abnormal seperti albino akan meningkat. Selain
senyawa tersebut senyawa ethrel juga sering digunakan untuk
praperlakuan pada media cair + 5 g/l ethrel (Gunawan, 1988).
d) Media tumbuh
· Komposisi media dasar tidak begitu kritis, namun dalam kultur
anther, NH4
+ yang tinggi (35mM) akan menghambat pembentukan
kalus.
· Sukrosa yang diberikan, berkisar 2-12%. Pada serealia digunakan
6-9%, sedangkan pada tanaman diploid 2-4%.
· ZPT yang biasa digunakan untuk memacu pertumbuhan
embriogenesis pada kultur anther adalah senyawa TIBA (Tri
iodobenzoic acid). Disamping itu penambahan 2 mg/l 2,4 D pada
media dasar digunakan untuk kultur anther padi, dan kombinasi
ZPT: 4 mg/l NAA + 1 mg/l 2,4 D dan 1-3 mg/l kinetin sering
ditambahkan pada media dasar untuk kultur anther.
· Penambahan bahan-bahan organik seperti: ekstrak pisang, air
kelapa, ensdosperm serealia, ekstrak ragi, alanin, folic acid dan
Co-enzym A, dapat memacu pertumbuhan pada kultur anther.
· Penambahan 2% arang aktif dapat memperbaiki androgenesis.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 55
e) Genotipe tanaman donor
Tidak semua kultivar dari setiap tanaman organ anthernya dapat
menghasilkan tanaman haploid.
f) Kondisi tanaman donor
· Umur fisiologi tananam donor ternyata dapat mempengaruhi
pertumbuhan tanaman anther. Bunga dari tanaman muda pada
saat permulaan pembungaan, ternyata lebih baik dari pada bunga
yang keluar kemudian.
· Kondisi nutrisi tanaman donor: tembakau yang diberikan perlakuan
larutan Hoagland selama 2 minggu, mempunyai bunga dengan
vigor yang lebih baik.
· Temperatur waktu menumbuhkan tanaman donor.
· Cahaya selama pertumbuhan tanaman donor.
2) Kultur serbuk sari (pollen culture)
Pollen (mikrospora) merupakan sel tunggal dan haploid dari sel kelamin
jantan. Pollen ini baik bila digunakan untuk diinduksi mutasi dan
manipulasi genetik lain.
Kultur pollen pertama kali berhasil pada tanaman Nicotiana tabacum.
Pada tahun 1974, Nitsch mengembangkan kutur terapung (Floating
culture) menggunakan media cair. Setelah itu pollen diletakkan di
permukaan media cair selama 2-3 hari. Setelah itu pollen ditekan keluar
dan media disaring dengan filter berukuran 25-100 mm tergantung dari
jenis. Suspensi kemudian dicentrifuge dan dicuci dengan larutan media.
Setelah dicuci disuspensikan kembali ke dalam media baru. Suspensi
dipipet dan dipindahkan ke media padat dalam petridish.
Dalam metode ini kuncup bunga yang sudah diberi praperlakuan suhu
rendah, diisolasi anthernya. Anther kemudian diapungkan di media cair.
Beberapa hari kemudian, anther terbuka (dehiscent) dan melepaskan
pollen ke dalam media.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 56
Pada kultur anther padi setelah 10 hari setelah inokulasi pada media cair,
massa sel mendesak keluar dari dinding pollen. Setelah beberapa hari
kalus putih mulai terlihat. Regenerasi kalus pada mulanya lebih rendah
dari yang di media padat, tetapi setelah medianya diperbaiki dengan
penambahan asam amino dan 20% ekstrak kentang, kemampuan
regenerasi meningkat.
a) Media
Media dasar yang digunakan untuk kultur pollen adalah media Nitsch
dengan penambahan Sukrosa 20 gram, 5 gram Myo-inosital ,
Glutamin 500 gram dan serin 30 mg, pH 5,8.
b) Bahan tanam
· Pollen diambil dari kuncup bunga yang masih muda, diperiksa
tingkat perkembangan androgenesis.
· Tingkat perkembangan pollen dari kuncup bunga diperiksa terlebih
dahulu.
· Kuncup bunga disterilisasi seperti pada kultur anther.
· Bunga yang telah disterilisasi diberi praperlakuan suhu antara 5-
10oC selama 10- hari.
· Bunga dicuci dengan aquadest steril sebelum digunakan.
· Kelopak bunga dan mahkota bunga, dibuka dengan hati-hati dan
diisolasi.
c) Penanaman
· Anther dimasukkan ke dalam media cair dan dibiarkan terapung
selama 4 hari pada temperatur 27 oC.
· Setelah 4 hari, anther ditekan kedinding botol kultur menggunakan
batang gelas steril.
· Saring media dan polen dengan filter 40 mm untuk tembakau.
· Centrifuge dengan 500-800 rpm selama 5 menit, pelet yang
diperoleh, dicuci menggunakan media baru.
· Ulangi pekerjaan tersebut sekali lagi, pelet disuspensikan ke dalam
media baru dengan ukuran volume tertentu.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 57
· Suspensi kultur pollen diambil setetes diperiksa kepekatan selnya
dengan menggunakan haemacytometer.
Ø Jumlah pollen yang berada di dalam 64 bidang dari
haehacytometer dihitung jumlah pollen rata-rata/0,25x0,25
mm bidang
Ø Konversikan ke jumlah pollen/ml. Tiap bidang 0,25x0,25 mm.
Volume 6.25x10-6 ml.
Ø Suspensi diencerkan hingga kerapatan pollen 103-104 /ml
Ø Suspensi pollen diambil menggunakan pipet sebanyak 5-10
ml dipindahkan pada petridish diameter 9 cm yang telah berisi
media isolasi pollen
Ø Kultur pollen diletakkan pada rak inkubator yang diberi
cahaya lemah 500 lux dengan temperatur 25oC.
Teknik di atas dimodifikasi oleh Nitsch menjadi:
· Anther dikultur terus di dalam media cair sampai dehiscent
· Polen yang ditaburkan di atas media akan tumbuh, tergantung pada
media dan jenis pertumbuhannya, melalui kalus atau embrio
· Pada kultur serealia, kalus terbentuk seteleh dipindah ke media
diferensiasi
· Media yang digunakan untuk menanam pollen padi adalah 1500 mg/l
KNO3, 100 mg/l Ca(NO3)2.4H2O, ekstrak kentang 20% dan untuk
media diferensiasi adalah media MS + 2 mg/l kinetin + 1 mg/l IAA +
3% sukrosa dan 0,57% agar.
3) Kultur bakal buah (ovule culture)
Pada tahun 1920 telah ditemukan terjadinya partenokarpi spontan di
dalam sel telur. Penemuan ini memacu para peneliti untuk
mengembangkan kultur ovul pada tahun 1950-1960, akan tetapi hasilnya
belum memuaskan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 58
Pada tahun 1970-an, beberapa hasil penelitian tentang kultur ovul muda
yang belum dibuahi, dipublikasikan, antara lain Gossypium hirsutum
(Jenson et al, 1977).
Pada dekade berikutnya tahun 1980-an, terdapat beberapa penelitian lagi
seperti Nicotiana tabacum (Ran, 1980 dalam Yang et al, 1986).
Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur ovul sebagian
merupakan faktor-faktor yang juga mempengaruhi keberhasilan kultur
polen, tetapi ada juga yang tidak sama. Faktor-faktor tersebut adalah:
a) Genotipe tanaman donor
Dari 19 varietas padi, terdiri dari 15 varietas japonica dan 4 varietas
dari Indica. Dari kelompok japonica, frekuensi gynogenesis berkisar
antara 1,1-2,8%. Frekuensi keberhasilan japonica dan Indica dalam
gynogenesis ini menunjukkan kecenderungan yang sama dengan
kemampuan androgenesis dari kelompok varietas tersebut.
b) Tingkat perkembangan kantong embrio.
Tingkat perkembangan embrio yang optimal adalah pada saat akhir
uninukleat sampai awal tetranukleat. Keadaan ini sukar diamati, tetapi
dapat disejajarkan dengan tingkat akhir uninukleat dan awal binukleat
dalam pollen.
c) Perlakuan temperatur rendah
Perlakuan suhu 12-13oC selama 6 hari sesudah ovari/ovul ditanam,
meningkatkan frekuensi gynogenesis, akan tetapi perlakuan
temperatur rendah bukan merupakan faktor kritis.
d) Bagian-bagian bunga.
Bagian-bagian bunga berperan dalam mengirimkan bahan-bahan
nutrisi dan bahan aktif lain ke bagian ovul. Hal ini terbukti bahwa
bagian-bagian bunga seperti pedicle, calyx atau glume memegang
peranan penting. Inokulasi bunga utuh (dengan pistil, stamen,
receptacle) menunjukkan hasil terbaik, bila stamen dibuang juga
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 59
masih menunjukkan hasil yang baik, sedangkan bila hanya bagian
pistil saja yang ditanam maka tidak ada respon yang diperoleh.
e) Bentuk fisik media
Media cair lebih mendukung gynogenesis dalam kultur ovul
dibandingkan dengan media padat. Hasil ini serupa dengan hasil yang
diperoleh dalam kultur anther.
f) Zat Pengatur Tumbuh
Kultur ovul padi
Media induksi:
Media dasar + 0,125-0,5 mg/l MCPA (2-methyl-4-chlorophenoxy acetid
acid + 0,125-0,5 mg/l Picloram (4-amino-3,5,6-tricloropicolinic acid +
3-6% sukrosa.
Media diferensiasi:
Media dasar + 2 mg/l kinetin + 0,5 mg/l IAA atau + 0,25 mg/l NAA +
3-6% sukrosa.
Media perakaran:
Media dasar + 0,5 mg/l IAA + 1,5% sukrosa + 0,1% arang aktif.
2. TUGAS-3
a. Apa manfaatnya kultur haploid dari segi pemuliaan tanaman?
b. Organ apa sajakah yang dapat diinduksi untuk membentuk tanaman haploid,
dan jelaskan keunggulan dan kelemahannya dari masing-masing organ
tersebut?
c. Hal-hal apa sajakah yang dapat mempengaruhi inisiasi dan pertumbuhan organ
pembentuk tanaman haploid secara invitro?
d. Bagaimana perkembangan pollen di dalam anther?
Jawaban tugas sebaiknya dikirimkan melalui e-mail ke alamat e-mail Dosen Anda
atau dapat dimasukkan/diposting ke blogger Anda, setelah itu Anda memberitahu
Dosen yang bersangkutan dapat melalui SMS atau cara yang lain.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 60
DAFTAR PUSTAKA
1. Chawla, H.S. 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd Edt. Science Publishers,
Inc. New Hampshire.
2. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
England. 236 p.
3. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
4. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge
University Press. London. 178 p.
5. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
Industries. Brisbane. 31 p.
6. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd.,
Basingstoke, England. 546 p.
7. Green, E.F. D.A. Somers, W.p. Hackett & D.P. Biesboer, 1987. Plant tissue and cell
culture. Alan R. Liss, Inc. New York. 509 p.
8. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian
Bogor. Bogor. 304 h.
9. Peirek, R.L.M., 1989. Invitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff Publishers.
Netherlands. 344 p.
10. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. Invitro plant Breeding. The Haworth
Press, Inc. New York.
11. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 61
D. KEGIATAN BELAJAR-4
1. LEMBAR INFORMASI-4
SILANGAN SECARA INVITRO (INVITRO POLLINATION)
a. Perkembangan Gametofit Betina
Dalam tumbuhan Angiosperm, gametofit betina di dalam kantong embrio
memproduksi inti-inti dalam jumlah terbatas. Jumlah inti dalam gametofit
dewasa berjumlah antara 4-16 buah inti, tetapi 80% dari tumbuhan berbunga
mempunyai 8 inti. Beberapa tipe gametofit betina yang dikenal, antara lain:
1) Jumlah spora yang berperan dalam pertumbuhan
2) Jumlah pembelahan mitosis setelah pembelahan meiosis dua kali
3) Jumlah total nuklei pada pembelahan sempurna
4) Organisasi seluler dari gametofit masak
Kebanyakan tipe umum gametofit betina adalah delapan nukleat (tipe
poligonum):
1) Sel telur bagian terpenting dan menonjol mempunyai struktur yang relatif
seragam. Ini berada dalam ujung mikrofil dan diapit oleh dua inti synergid
2) Sinergid tampak berperan aktif dalam pembuatan nutrisi bagi kantong
embrio, menarik tabung pollen dan sebagai buffer osmotik untuk melepas
isi tabung pollen
3) Sel kutub (sel pusat binukleat) atau sel pusat garam organik berperan
sebagai sel induk endosperm setelah fertilisasi
4) Sel antipoda berjumlah tiga bertugas sebagai tempat melakukan
metabolisme dan berperan dalam menyuplai nutrisi.
b. Penyerbukan (Polinasi)
Penyerbukan didefinisikan sebagai peristiwa pemindahan atau jatuhnya
pollen dari anther pada kepala putik (stigma) baik pada bunga yang sama
atau bunga lain yang masih dalam satu spesies. Jika pollen sesuai
(compatible), pollen akan berkecambah pada kepala putik dan membentuk
sebuah tabung pollen yang akan membawa gamet jantan pada gametofit
betina. Suatu senyawa protein tertentu pada awal pembentukan pollen yang
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 62
disebut Lectin, terdapat di dalan exine dan intine. Lectin berperan penting
dalam mekanisme mengenali antara putik-pollen. Namun bila pollen tidak
sesui (incompatible), perkecambahan pollen akan terhambat atau
pertumbuhan tabung pollen akan tertahan dalam jaringan pemindah.
Ketidaksesuaian dapat diwujudkan dalam jaringan baik kepala putik maupun
stylus pada berbagai fase sebelum pembuahan (fertilisasi). Karena adanya
ketidaksesuaian antara pollen dan stigma maka pekerjaan pemuliaan
tanaman adalah mengatasinya agar tetap bisa berlangsung fertilisasi,
dengan mengembangkan beberapa metode, antara lain:
1) Polinasi kuncup
2) Polinasi tertunda
3) Polinasi invitro
4) Polinasi intra ovari
Pemanjangan tabung pollen adalah tetap untuk setiap spesies. Ketika butir
pollen siap dipencarkan, pollen ini dalam keadaan dormansi dengan kadar air
antara 10-15% hampir mirip dengan biji. Pada Gramineae mempunyai umur
pollen yang relatif pendek, misalnya pollen Paspalpum akan kehilangan
viabilitasnya setelah 30 menit. Kebanyakan pada tanaman berbunga pollen
akan mengalami penurunan secara drastis setelah 12 jam mengalami
dehiscence. Namun viabilitas pollen dapat diperpanjang dalam keadaan
artifisial yaitu bila disimpan pada temperatur dan kelembaban yang rendah.
Pollen akan segera berkecambah setelah beberapa menit dilepas oleh
anther, bila ketersediaan dari air, garam anorganik tertentu, termasuk boron
dan sumber energi seperti sukrose cukup. Tabung pollen akan masuk ke
dalam stigma melalui diantara sel-sel jaringan pemindah di dalam stylus dan
akhirnya mencapai ovul. Waktu yang diperlukan pollen untuk mencapai ovul
antara 12-24 jam. Waktu yang digunakan untuk proses tersebut setiap
spesies tidak sama, seperti pada Taraxacum diperlukan 15 menit sedangkan
pada pohon Quercus memerlukan waktu 14 bulan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 63
c. Pembuahan (Fertilization)
Pada tumbuhan Angiospermae, dua gamet jantan dibawa oleh tabung pollen
untuk terjadinya proses fertilisasi. Satu gamet akan melebur dengan inti telur
membentuk embrio dan yang lain melebur dengan dua inti kutub membentuk
endosperm. Proses ini dikenal sebagai pembuahan ganda. Persilangan
sexual suatu cara yang potensial untuk memproduksi tanaman yang
superior dengan mengkombinasikan sifat-sifat dalam individu yang berbeda
atau spesies atau bahkan genera yang berbeda. Persilangan antar spesies
atau takson di atasnya dapat dilakukan dengan salah satu teknik seperti
artifisial polinasi dari induk betina dengan pollen dari induk jantan terseleksi.
Tujuan utama program pemuliaan tanaman sampai saat ini adalah untuk
meningkatkan hasil (produktivitas) tanaman melalui perbaikan karakterkarakter
tanaman dalam kondisi lingkungan pertanaman yang normal
maupun cekaman lingkungan. Untuk mencapai tujuan di atas, pemulia
menempuh langkah-langkah seleksi populasi, penggabungan karakter yang
diinginkan melalui persilangan, perluasan variasi genetik melalui mutasi (bila
karakter yang diinginkan tidak ada di alam), atau penyisipan gen untuk
memproduksi tanaman transgenik. Langkah-langkah pemuliaan tersebut
dapat ditempuh melalui persilangan konvensional maupun modern.
Pemuliaan tanaman secara konvensional telah menghasilkan banyak sekali
varietas-varietas unggul, namun juga menghadapi berbagai kendala seperti
waktu produksi yang panjang, adanya inkompatibilitas yang sering
menyebabkan kegagalan persilangan serta adanya mekanisme dari tanaman
sendiri (umumnya pada Angiospermae) untuk mencegah terjadinya selfpollination.
d. Kendala dalam persilangan
Kendala yang sering dihadapi dalam persilangan dalam pemindahan pollen
viable dari satu induk ke stigma lain penerima tidak selalu dapat membentuk
biji, antara lain disebabkan:
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 64
1) Sebelum pembuahan atau sebelum pembentukan zigot
(prefertilization atau prezygotic)
a) Incompatibility antara serbuk sari dengan putik sehingga menghambat
terjadinya pembuahan
b) Terhambatnya perkecambahan pollen atau tabung pollen gagal
mencapai ovul yang disebabkan stylus terlalu panjang atau
pertumbuhan tabung pollen yang terlalu pelan sehingga tabung pollen
baru mencapai dasar stylus sebelum bengkak (abcises)
c) Tabung pollen pecah di dalam stylus
d) Biochemical incompatibility, yaitu tangkai putik mengeluarkan
senyawa kimia tertentu sehingga pollen yang telah berkecambah tadi
tidak bisa menembus tangkai putik (stylus) sehingga perkembangan
tabung pollen terhenti sampai stylus
e) Pertumbuhan tabung serbuk sari hanya mencapai microphyl.
2) Setelah terjadi pembuahan (post fertilization)
a) Terjadi fusi pada inti-inti gametnya sehingga mencegah pembuahan
b) Pembuahan terjadi tetapi embrio hibrid gagal berkembang hingga
masak disebabkan adanya ketidaksesuaian antara embrio-endosperm
atau pertumbuhan endosperm sangat miskin
c) Setelah terjadi pembuahan, perkembangan embryo terhambat
d) Tidak terbentuk endosperm yang memadai
e) Biji yang terbentuk terganggu proses penuaannya
f) Biji yang dihasilkan viabilitasnya rendah (menghambat
perkecambahan)
Kendala-kendala di atas seringkali menyebabkan kegagalan produksi
hibrida. Kendala yang terjadi setelah pembuahan dapat diatasi dengan
perkecambahan embrio (embryo culture dan embryo rescue) sedangkan
kendala sebelum pembuahan dapat diatasi dengan salah satu teknik
kultur jaringan yaitu Invitro pollination atau pembuahan secara invitro.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 65
e. Prosedur umum pembuahan invitro
Prosedur pembuahan invitro pada Nicotiana tabaccum adalah sebagai
berikut:
1) Pengumpulan pollen
2) Pengujian viabilitas pollen
3) Pembuahan invitro, ada dua teknik yaitu:
a) Stigma fertilization
b) Placenta fertilization
1) Pengumpulan/koleksi pollen (serbuk sari)
Tahapan pertumbuhan pollen sangat menentukan keberhasilan
pembuahan, oleh karena itu harus dipilih benang sari yang telah
berkembang penuh dan siap membuka (sesaat sebelum pollen
disebarkan oleh benang sari). Benang sari ini disterilkan lalu didalam
laminar air flow pollen tersebut dikumpulkan ke atas gelas mikroskop.
2) Test viabilitas pollen
Viabilitas pollen dapat diukur dengan cara menguji sebagian kecil pollen
yang telah dikumpulkan. Caranya adalah mengkulturkan/
mengecambahkan pollen tadi ke dalam media yang mengandung sucrose
(10%), boric acid (0,01%), CaCl2.2H2O dan agar (0,75%). Obseervasi
dilakukan dibawah mikroskop terhadap perkecambahan pollen.
3) Penyerbukan invitro
Secara terminologi penyerbukan invitro dibedakan menjadi 3 metode,
yaitu:
a) Penyerbukan kepala putik (stigma pollination)
Yaitu teknik penyerbukan dengan cara menaburkan serbuk sari
langsung ke atas tangkai putik (stylus) dengan cara terlebih dahulu
memotong kepala putiknya (stigma). Putik yang tidak memiliki stigma
ini terlebih dahulu dikulturkan dalam botol kultur dengan media yang
sesuai.
b) Penyerbukan plasenta (placental pollination)
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 66
Yaitu teknik penyerbukan dengan cara menaburkan serbuk sari
(pollen) langsung ke atas placenta (tali pusat) yang terdapat dalam
badan buah (ovule) dengan cara terlebih dahulu memotong badan
buah pada pistil sampai ovule sehingga placentanya terlihat, bagian ini
dikulturkan dalam botol kultur baru kemudian dilakukan penyerbukan
dengan meletakkan pollen langsung di atas placenta sebagaimana
diperlihatkan pada gambar 2.
Gambar 2. Fertilisasi Plasenta; Bakal buah dipotong melintang
Selanjutnya pollen ditaburkan pada ovul
c) Penyerbukan bakal biji (ovular pollination)
Yaitu penyerbukan secara artifisial dengan cara menaburkan pollen
langsung pada bakal biji (ovule) dengan cara mengeluarkan ovule dari
ovarium (bakal buah) terlebih dahulu.
Keberhasilan dari teknik polinasi invitro sangat tergantung pada:
1) Eksplan butir pollen dan ovul pada fase perkembangan yang tepat
2) Pemilihan media yang tepat yang dapat memacu perkecambahan
tabung pollen dan perkembangan embrio.
Beberapa aspek biologi pembungaan harus dikuasai, seperti:
1) Anthesis
2) Dehiscence anther
3) Polinasi
4) Perkecambahan pollen
5) Pertumbuhan tabung pollen
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 67
6) Penetrasi ovul
7) Fertilisasi
8) Perkembangan embrio dan endosperm.
f. Aplikasi Fertilisasi Invitro
Teknik ini mempunyai manfaat untuk pemuliaan tanaman, antara lain seperti:
1) Produksi hibrid dari hasil silangan antar spesies, antar genera, antar
familia, ordo, classis ataupun divisio
2) Induksi tanaman haploid yang dapat dihasilkan dengan cara: polinasi
tertunda, hibridisasi berjarak (hibrid antar spesies yang berbeda), polinasi
dengan pollen abortif atau pollen yang telah diradiasi dan induksi haploid
pada ovary dengan perlakuan fisik atau kimiawi
3) Mengatasi ketidaksesuaian sexual self
4) Untuk mempelajari fisiologi pollen dan fertilisasi.
Hal-hal yang mendukung keberhasilan fertilisasi invitro untuk
menghasilkan biji yang viable, antara lain adalah:
1) Umur eksplan terutama ovul
2) Perkecambahan pollen cukup
3) Tabung pollen dan gametogenesis pada pertumbuhan yang tepat
4) Tabung pollen dapat masuk ke dalam ovul
5) Derajat fertilisasi
6) Penambahan casein hydrolysate 500 mg/l pada beberapa kasus dapat
memacu pembentukan biji yang viable.
2. TUGAS-4
a. Apakah manfaat dari polinasi invitro?
b. Pada proses polinasi baik secara invivo maupun invitro sering terdapat suatu
kendala, apa sajakah kendala-kendala yang dapat menyebabkan kegagalan
dalam membentuk biji yang sempurna dan bagaimanakah caranya untuk
menyelamatkan hibridisasi yang telah terjadi tersebut?
c. Coba jelaskan metode-metode polinasi invitro yang dapat menghilangkan
kondisi inkompatibilitas!
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 68
d. Apakah tipe gametofit betina pada tumbuhan Angiospermae yang umum
dijumpai dan jelaskan fungsi setiap sel pada kantong embrio?
e. Metode polinasi apa sajakah yang dapat dikembangkan oleh pemulia tanaman?
Jawaban tugas sebaiknya dikirimkan melalui e-mail ke alamat e-mail Dosen Anda
atau dapat dimasukkan/diposting ke blogger Anda, setelah itu Anda memberitahu
Dosen yang bersangkutan dapat melalui SMS atau cara yang lain.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 69
DAFTAR PUSTAKA
1. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
England. 236 p.
2. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
3. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge
University Press. London. 178 p.
4. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
Industries. Brisbane. 31 p.
5. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture.
Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd.,
Basingstoke, England. 546 p.
6. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian
Bogor. Bogor. 304 h.
7. Peirek, R.L.M., 1989. Invitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff Publishers.
Netherlands. 344 p.
8. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshamanan, 2002. Invitro plant breeding. The Haworth
Press, Inc. New York
9. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 70
E. KEGIATAN BELAJAR-5
1. LEMBAR INFORMASI-5
KULTUR EMBRIO DAN PENYELAMATAN EMBRIO
(EMBRYO CULTURE AND EMBRYO RESCUE)
Pada program pemuliaan tanaman, biasanya dilakukan persilangan buatan
antara tanaman induk (P) untuk menghasilkan hibrid baru. Persilangan buatan
lebih mudah berhasil bila dilakukan antar tanaman dengan hubungan
kekerabatan yang dekat. Untuk memperoleh sifat-sifat yang diinginkan,
seringkali penyilangan dilakukan dengan tanaman liar atau bahkan persilangan
dengan varietas yang berbeda bila sifat-sifat tersebut tidak terdapat pada
kerabat dekatnya.
Penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah persilangan buatan
seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat
embrio belum matang, terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau
terbentuk buah dengan embrio yang kecil dan lemah. Kondisi tersebut dapat
menghambat program pemuliaan tanaman karena embrio muda, embrio dengan
endosperm kecil atau embrio kecil dan lemah seringkali tidak dapat
berkecambah secara normal dalam kondisi biasa.
Untuk mengatasi hal tersebut di atas maka embrio tersebut dapat diselamatkan
dan ditanam secara aseptis dalam media buatan sehingga dapat berkecambah
dan menghasilkan tanaman utuh. Teknik untuk menanam embrio muda ini
dikenal dengan sebutan penyelamatan embrio (embryo rescue).
Selain teknik penyelamatan embrio ini dikenal juga teknik kultur embrio (embryo
culture), yaitu penanaman embrio dewasa pada media buatan secara aseptis.
Aplikasi kultur embrio ini antara lain perbanyakan tanaman, pematahan
dormansi untuk mempercepat program pemuliaan serta perbanyakan tanaman
yang sulit berkecambah secara alami.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 71
Embryo Culture atau kultur embrio adalah isolasi steril dari embrio muda
(immature embryo) atau embrio dewasa/tua (mature embryo) secara invitro
dengan tujuan untuk memperoleh tanaman yang lengkap. Embrio culture adalah
salah satu teknik kultur jaringan yang pertama kali berhasil.
a. Penggolongan Kultur Embrio
Berdasarkan tujuan dan jenis embrio yang dikulurkan, kultur embrio
digolongkan menjadi:
1) Kultur embrio muda (immature embryo culture)
Tujuan mengkulturkan embrio muda ini adalah menanam embrio yang
terdapat pada buah muda sebelum buah tersebut gugur (mencegah
kerusakan embrio akibat buah gugur) sehingga teknik ini disebut sebagai
Embryo Rescue (Penyelamatan Embrio). Kondisi seperti ini biasanya
sering dijumpai pada buah hasil persilangan, dimana absisi buah kerap
kali dijumpai setelah penyerbukan dan pembuahan.
Budidaya embrio muda ini lebih sulit dibandingkan dengan budidaya
embrio yang telah dewasa. Embrio yang terdapat dalam biji belum
sepenuhnya berkembang dan belum membentuk radikula dan plumula
yang sempurna. Selain itu, biji belum memiliki endosperm atau cadangan
makanan yang memadai dalam mendukung perkembangan dan
perkecambahan embrio. Oleh karena itu, perlu disediakan media kultur
yang memadai bagi perkembangan embrio muda ini. Pada beberapa
kasus kadangkala dijumpai embrio masih dorman sehingga perlu
ditambahkan hormon tanaman yang bisa memecahkan dormansi biji ini,
misalnya giberellin.
2) Kultur embrio dewasa ( mature embryo culture)
Kultur embrio dewasa dilakukan dengan membudidayakan embrio yang
telah dewasa. Embrio ini diambil dari buah yang telah masak penuh
dengan tujuan merangsang perkecambahan dan menumbuhkan embrio
tersebut secara invitro. Teknik kultur ini umumnya dikenal dengan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 72
sebutan Kultur Embrio (Embryo Culture). Kultur embrio lebih mudah
dilakukan dibandingkan dengan penyelamatan embrio. Hal ini disebabkan
karena embrio yang ditanam adalah embrio yang telah berkembang
sempurna sehingga media tanaman yang digunakan juga sangat
sederhana.
3) Kultur embrio non zigotik
Embrio non zigotik dihasilkan dari kultur organ yang melalui fase
pertumbuhan kalus. Dimulai dari pertumbuhan sel, sel-sel kemudian
membentuk kalus dari kalus akan membentuk globular dan globular ini
akan membentuk bangunan seperti torpedo dan akhirnya terbentuklah
embrio non zigotik Embrio nonzigotik tumbuh dari sel tunggal, namun
pembentukan tunasnya berasal dari massa sel. Perbedaan penting
mengenai efisiensi teknologi genetik selama modifikasi sel embriogenik
tunggal dapat secara nyata memodifikasi sifat tanaman dibandingkan
yang harus melalui modifikasi genetik terlebih dahulu dari sebuah sel di
dalam tunas, hal ini akan mengakibatkan terbentuknya tanaman chimera
(Trigiano & Gray, 2004).
Gambar 3. Embrio Non zigotik Dihasilkan dari Kultur Pollen atau
Protoplasma yang Nyata Berkembang dari Sel Tunggal
(sumber: Taji, Kumar & Lakshmanan, 2002).
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 73
b. Aplikasi Praktis Kultur Embrio
Kedua teknik ini (embryo culture dan embryo rescue) dewasa ini dilakukan
untuk berbagai tujuan, antara lain:
1) Mematahkan dormansi
Beberapa spesies tanaman memiliki masa dormansi yang panjang. Untuk
memecahkan masalah tersebut, maka biji tanaman ini dapat
dikecambahkan secara invitro. Dormansi fisik dapat dipatahkan dengan
cara mengisolasi embrio dari biji lalu mengecambahkannya, sedangkan
dormansi fisiologis dapat dipecahkan dengan perlakuan kimia seperti
penambahan giberellin (GA3) ke dalam media kultur.
2) Memperpendek siklus pemuliaan tanaman
Dormansi biji dapat menghambat program pemuliaan tanaman.
Pemecahan dormansi dengan kultur embrio (embryo culture)
merupakan salah satu upaya untuk mempercepat perkecambahan biji
hasil pemuliaan tanaman sehingga bisa mempercepat proses pemuliaan
tanaman.
3) Produksi tanaman haploid lewat penyelamatan embrio hasil
persilangan antar jenis tertentu
Salah satu cara yang dilakukan untuk memperoleh tanaman haploid
adalah silangan antar spesies tertentu. Contohnya adalah persilangan
antara Hordeum vulgare dengan H. bulbosum. Setelah penyilangan yang
kemudian diikuti oleh pembuahan, kromosom H. bulbosum tereliminasi
sehingga hanya kromosom H. bulbosum yang terekspresi, sehingga
dapat dihasilkan biji haploid dari silangan ini. Sayangnya persilangan ini
mengakibatkan embrio gugur (buah gugur) sebelum buah tersebut
dewasa. Hasil silangan ini (buah haploid) tidak akan dapat diperoleh
apabila buah muda tersebut tidak diselamatkan dengan cara
memanennya sebelum gugur lalu mengecambahkan embrio muda (teknik
embryo rescue) ini secara invitro.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 74
4) Mencegah gugurnya buah (embrio) pada buah
Gugurnya buah sebelum buah tersebut dewasa sangat umum ditemukan
pada persilangan. Berbagai macam faktor dapat menyebabkan buah
tersebut gugur sebelum masak. Pada persilangan buah-buah batu,
transportasi air dan hasil fotosintesa dari daun dan batang ke buah
terhambat sehingga mengakibatkan terbentuknya lapisan absisi pada
tangkai buah. Akibatnya buah tidak memperoleh nutrisi yang dibutuhkan
untuk perkembangannya sehingga buah dengan embrio yang terbentuk
gugur sebelum dewasa. Teknik embryo rescue umumnya dilakukan
untuk menyelamatkan hasil silangan ini dengan cara memanen buah
muda hasil persilangan sebelum buah gugur kemudian
mengecambahkannya secara invitro.
5) Mencegah kehilangan biji setelah persilangan (interspesific)
Persilangan antar varietas tanaman dalam satu spesies seringkali
menghasilkan buah dengan endosperm yang miskin atau embrio lemah
dan berukuran kecil. Biji-biji dengan kondisi demikian seringkali sulit
sekali atau tidak bisa dikecambahkan dalam kondisi normal. Teknik
kultur embrio dapat digunakan untuk membantu perkecambahannya, hal
ini telah dilakukan pada tanaman kapas.
6) Perbanyakan vegetatif
Embrio dapat digunakan sebagai bahan dasar perbanyakan vegetatif
seperti misalnya pada Poaceae dan paku-pakuan (menggunakan spora).
c. Teknik Dasar Kultur Embrio
Teknik embryo culture dan embryo rescue pada dasarnya melibatkan 3
tahapan, yaitu:
1) Sterilisasi eksplan
Embrio pada prinsipnya berada dalam keadaan steril. Hal ini disebabkan
karena embrio berada di dalam buah (di dalam biji) terlindung oleh
jaringan-jaringan buah dan biji yang berada di luar embrio, antara lain
oleh kulit buah, daging buah dan kulit biji. Keadaan ini menyebabkan
sterilisasi embrio tidak perlu dilakukan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 75
Sterilisasi permukaan perlu dilakukan pada buah ataupun biji untuk
mensterilkan permukaan buah/biji sehingga pada waktu isolasi embrio
tidak terdapat sumber kontaminan. Karena embrio berada di dalam,
sterilisasi dapat dilakukan dengan pembakaran buah/biji atau dengan
sterilan kimia seperti sodium hypochlorite dengan konsentrasi cukup
tinggi (>2%).
2) Isolasi dan penanaman embrio
Seringkali masalah timbul saat isolasi embrio terutama untuk embrio
berukuran kecil sehingga isolasinya harus dilakukan di bawah mikroskop.
Untuk embrio berukuran besar, isolasi embrio tidak menjadi masalah.
Isolasi harus dilakukan secara hati-hati agar embrio tidak rusak dan
kehilangan salah satu atau lebih bagian-bagiannya (radicula, plumula,
hypocotil, coleoptyl, dll). Selain itu harus tetap dijaga juga agar isolasi
dilakukan dalam kondisi tetap aseptis. Embrio yang telah diisolasi
selanjutnya ditanam pada media yang telah dipersiapkan.
Gambar 4. Skema Isolasi dan Kultur Embrio (sumber: Taji, Kumar &
Lakshmanan,2002)
Media untuk pengecambahan embrio cukup sederhana. Kebutuhan nutrisi
di dalam media untuk pengecambahan embrio juga lebih sederhana
dibandingkan dengan media untuk tujuan teknik kultur yang lain. Pada
prinsipnya media diperlukan untuk menggantikan peranan endosperm
biji muda
Kultur
embrio
Pembesaran
planlet
Potting
plantlet
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 76
dalam mendukung perkecambahan embrio dan perkembangan bibit muda
mengingat embrio yang ditanam umumnya telah memiliki radikula dan
plumula. Media yang umum digunakan untuk pengecambahan embrio
adalah Media MS dalam ½ konsentrasi garam-garamnya. Dalam
pengecambahan embrio dewasa umumnya vitamin tidak ditambahkan
dalam media, namun sumber karbon tetap diperlukan meskipun dalam
konsentrasi yang lebih rendah (umumnya 20 g/l). Akan tetapi, dalam
pengecambahan embrio muda diperlukan media yang lebih kompleks.
Perkembangan embrio muda perlu didukung pada awalnya sehingga
radikula dan plumula dapat berkembang sempurna sebelum embrio ini
berkecambah. Untuk itu, nutrisi yang lebih lengkap beserta vitamin seperti
nicotinic acid, biotin, vitamin C, vitamin B perlu ditambahkan pada media
kultur embrio muda ini. Hormon tanaman umumnya tidak ditambahkan
dalam media kultur embrio karena penambahan hormon tanaman
kemungkinan dapat merangsang terbentuknya kalus pada embrio.
Kalus umumnya tidak diinginkan pada kultur embrio mengingat tujuan
kulturnya adalah untuk merangsang perkecambahan embrio. Pada
beberapa kasus, terutama untuk embrio muda atau embrio yang
mengalami dormansi, penambahan giberellin dalam media kultur dapat
dilakukan. Untuk pengecambahan embrio umumnya digunakan media
padat sehingga agar pada konsentrasi 0,8 sampai 1,6 % ditambahkan ke
dalam media. Media cair kadangkala diperlukan untuk pengecambahan,
misalnya pada embrio kelapa. Kondisi pengecambahan ini memodifikasi
kondisi alamiah perkecambahan buah kelapa dimana nutrisi tersedia dari
endosperm yang cair yaitu berupa air kelapa. Apabila media cair
digunakan untuk pengecambahan, umumnya kultur ditempatkan di atas
shaker (alat penggojok) untuk menghindari kekurangan oksigen pada
eksplan yang dapat menyebabkan eksplan mati.
3) Aklimatisasi
Aklimatisasi dilakukan setelah embrio berkecambah dan diperoleh plantlet
yang siap untuk dipindahkan ke lapangan. Teknik aklimatisasi untuk
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 77
plantlet hasil regenerasi kultur embrio pada prinsipnya sama dengan
aklimatisasi plantlet hasil regenerasi dari teknik kultur jaringan lainnya.
2. TUGAS-5
a. Apa sajakah manfaat dari kultur embrio?
b. Coba jelaskan tipe-tipe embrio? Apa perbedaan dari masing-masing tipe embrio
tersebut?
c. Sebutkan beberapa contoh aplikasi dari kultur embrio!
d. Coba terangkan teknik kultur embrio secara invitro!
Jawaban tugas sebaiknya dikirimkan melalui e-mail ke alamat e-mail Dosen Anda
atau dapat dimasukkan/diposting ke blogger Anda, setelah itu Anda memberitahu
Dosen yang bersangkutan dapat melalui SMS atau cara yang lain.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 78
DAFTAR PUSTAKA
1. Bhojwani & Razdan, 1983. Plant Tissue Culture: Theory and Practise.
2. Debergh & Zimmerman, 1990. Micropropagation: Technology & Application.
3. Evan, Sharp, Amminoto & Yamada., 1983/1984. Handbook of Plant Cell Culture
(Vols 1 􀂱 4).
4. George, 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: Part 1 The Technology,
Exegetics, London.
5. Green, Somers, Hacket & Biesboer, 1987. Plant Tissue and Organ Culture.
6. Kantharajah, A.S., 1995. Plant tissue culture and crop improvement laboratory
manual. Indonesia Australia Eastern Universities Project. Universitas
Mataram. Mataram.
7. Pierik, 1987. Invitro Culture of Higher Plants.
8. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. Invitro plant Breeding. The Haworth
Press, Inc. New York.
9. Thorpe, 1981. Plant Tissue Culture: Methods & Applications in Agriculture.
10. Torres, 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops.
11. Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory
exercises. 2nd Adt. CRC Press. New York
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 79
F. KEGIATAN BELAJAR-6
1. LEMBAR INFORMASI-6
KULTUR PROTOPLASMA DAN FUSI PROTOPLASMA
(HIBRIDISASI SOMATIK)
a. Pengertian Kultur Protoplasma
Istilah protoplasma pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun
1880, yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah
dikupas bagian dinding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus
oleh dinding sel. Isolasi protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara:
1) Metode mekanikal
Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali
oleh Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan
cara mengupas dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Kelebihan
dari metode ini adalah sel yang digunakan mempunyai vakuola sel yang
relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: keberhasilannya rendah;
pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan;
viabilitas protoplasma rendah, karena sering terjadi kerusakan
protoplasma selama proses pengupasan dinding sel.
2) Metode enzimatik
Isolasi protoplasma menggunakan bantuan enzim. Orang pertama yang
melakukan metode ini adalah Cocking pada tahun 1960, Cocking
mengisolasi protoplasma menggunakan enzim selulase. Enzim selulase
diisolasi dari jamur Myrothecium verrucaria. Namun orang pertama
yang menggunakan enzim komersial untuk mengisolasi protoplasma dan
berhasil meregenerasikan adalah Takabe dan kawan-kawan pada tahun
1968.
b. Organ Sebagai Sumber Protoplasma
Protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti:
daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 80
Diantara organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi
protoplasmanya adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena:
1) Bentuk selnya relatif seragam
2) Tidak perlu membunuh tanamannya
3) Dinding sel mudah terkelupas oleh enzim.
Sumber protoplasma selain diperoleh dari organ tersebut di atas dapat juga
berasal dari kalus dan sel suspensi. Untuk sumber yang berasal dari kalus,
paling baik berasal dari kalus yang remah (friable) dengan kandungan
karbohidrat rendah sedangkan yang berasal dari sel suspensi, paling baik
diambil pada fase pertumbuhan exponensial.
Salah satu teknik kultur jaringan yang dewasa ini berkembang pesat adalah
teknik kultur protoplasma. Bagian-bagaian sel tumbuhan, termasuk
protoplasma, secara umum dijelaskan pada Gambar 4. Protoplasma ini dapat
diisolasi dari sel dan kemudian dikulturkan secara invitro.
Gambar 5. Sel Mesofil Daun
Kultur protoplasma dapat digunakan untuk berbagai macam tujuan seperti
perbanyakan dan untuk memperoleh varietas baru. Teknik yang digunakan
untuk memperoleh hibrida ini antara lain perlakuan protoplasma dengan
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 81
mutagen dan manipulasi genetik ditingkat sel melalui fusi (penggabungan)
dua protoplasma dari varietas atau spesies yang berbeda serta penggunaan
protoplasma dalam rekayasa genetika ditingkat molekuler dengan teknik
elektroporasi, mikro injeksi atau partikel bombardment.
Jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan untuk kultur protoplasma
ini bermacam-macam termasuk jaringan yang masih memiliki sel-sel
parenchyma (dindingnya belum berlignin).
Biasanya jaringan tanaman diiris halus lalu diplasmolisis (sedikit) dalam
larutan manitol untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) sitoplasma
dengan dinding selnya. Setelah dimodifikasi, di dalam kultur protoplasma
akan membentuk dinding sel kemudian membelah membentuk koloni sel
seperti kalus (callus-like cells). Protoplasma memerlukan media tanam yang
lebih kompleks untuk dapat bertahan hidup dan beregenerasi. Biasanya
ditambahkan suatu osmotikum (misalnya sorbitol, manitol) ke dalam media
awal sebelum dinding selnya terbentuk untuk mencegah plasmolisis.
c. Prosedur Kultur Protoplasma
Kultur protoplasma dilakukan secara bertahap mulai dari persiapan eksplan
dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma
dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa mutagen ke dalam media
tanam atau dengan memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen
tersebut. Silangan somatik dilakukan dengan cara penggabungan dua buah
protoplama segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur
protoplasma secara umum adalah sebagai berikut:
1) Persipan eksplan
Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam,
umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang
mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari
kecambah, bibit, plantlet), dan pucuk adventif hasil pangkasan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 82
Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi
protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri
dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel
parenchyma (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada juga yang
menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi
protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah
berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder.
2) Sterilsasi eksplan
Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu
dicuci kemudian disterilkan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit
􀀔􀂱2% selama 10􀂱30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan.
Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril (3􀂱4 kali) untuk
mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan.
3) Isolasi protoplasma
Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzim yang dapat
menghancurkan dinding sel. Enzim yang digunakan bervariasi jenis dan
konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur
jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya. Berikut
dikemukakan perbandingan antara dinding sel primer dan sekunder pada
sel tumbuhan.
Tabel 2. Perbandingan Komposisi Dinding Sel Primer dan Sekunder
Komponen Dinding sel primer Dinding sel sekunder
Polisakarida 90 % 60 - 85 %
cellulose 30 % 50 - 80 %
hemicellulose 30 % 5 - 30 %
pectin 30% -
Protein 10% -
Lignin - 15 - 35 %
______________________________________________________
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 83
Enzim yang digunakan untuk menghancurkan dinding sel tumbuhan
umumnya ada 3, yaitu:
a) Cellulase untuk menghancurkan sellulose
b) Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose
c) Pectinase untuk menghancurkan pektin.
Alat-alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur protoplasma adalah
sebagai berikut :
a) Laminar air flow cabinet
b) Centrifuge
c) Inverted microscope
d) Gyratory shaker
e) Magnetic stirrer+hot plate
f) pH meter
g) Saringan stainless stell (lubang 60 -70 mm)
h) Bacterial filter
i) Nalgene filter unit 0,22 mm
j) Millex filter unit 0,45 mm
k) Spet dan jarum
l) Pinset dengan ujung runcing+pisau kultur
m) Pipet 5 ml berujung lebar
n) Pipet pastur 2 ml
o) Petridish
p) Gelas beker
q) Parafilm/plastic wrapp
Bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai
berikut:
a) Eksplan dapat berupa: jaringan mesophyll daun, callus atau sell
suspensi, akar, tuber, bintil akar, petal, pollen, endosperm, aleurone,
coleoptil, radikula
b) Ethanol 70%
c) Larutan isolasi protoplasma
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 84
4) Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma
Jaringan tanaman seperti daun tembakau disterilkan terlebih dahulu
dengan cara merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detik
selanjutnya di rendam kedalam larutan pemutih (misalnya bayclean) 20%
yang ditambah beberapa tetes tween selama 15 menit. Selanjutnya daun
tembakau tersebut dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga
kali.
a) Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas epidermis serta
dihilangkan urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing
steril, untuk lebih memudahkan isolasi protoplasmanya.
Contoh campuran dan konsentrasi enzim yang digunakan untuk
isolasi protoplasma beragam dan tergantung dari jenis jaringan yang
digunakan sebagai eksplan, seperti:
Medium enzim untuk jaringan akar
· 2 % rhozyme
· 2 % meicellase
· 0,03 % macerozyme R10
Medium enzim untuk daun serealia
· 2 % cellulysin
· 0,2 % macerozyme R10
· 0,5 % hemicellullase
· 11 % mannitol
Medium enzim untuk daun tembakau
· 0,5 % Onozuka R10 cellulase
· 0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10
· 13,0 Mannitol
· pH 5,8
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 85
b) Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma
dengan dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditambahkan
senyawa osmoticum. Senyawa osmoticum yang dapat digunakan
antara lain:
· Mannitol
· Sorbitol
· Glukosa
· Fruktosa
· Galaktosa
· Sukrosa
c) Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20
ml larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium
preplasmolisis untuk setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau
medium preplasmolisis tersusun atas medium isolasi protoplasma
ditambah 13% mannitol.
Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:
· CaCl2.H2O : 1480,0 mg/l
· KH2PO4 : 27,2 mgl
· KNO3 : 101,0 mg/l
· MgSO4.7H2O : 246,0 mg/l
· CuSO4.5H2O : 0,025 mg/l
· KI : 0,16 m g/l
· pH : 5,8
d) Eksplan dipindah ke larutan medium enzim (komposisi media ini juga
berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan), untuk daun
tembakau komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke
tabung steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung
ditutup dengan aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan
parafilm atau plastik wrap. Tabung berisi eksplan tersebut digoyang
pada shaker dengan kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-16
jam.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 86
5) Pemurnian protoplasma
a) Protoplasma dalam poin d) disaring dengan filter steril, mess 63 μm,
masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet
pasteur.
b) Medium pencuci (MIP ditambah + 10%) sebanyak 3 ml ditambahkan
ke dalam cawan petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan
dan kombinasikan dengan protoplas/campuran enzim dalam gelas
piala volume 250 ml.
c) Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring.
Protoplas yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge
dengan kecepatan 50 x g selama 10 menit.
d) Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml
ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma
akan melayang-layang diantara medium flotasi (MIP+20%) dan
medium pencuci.
e) Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung
ditambah 10 ml medium pencuci, selanjutnya disentrifuge maka
protoplasma akan mengendap sebagai pelet.
f) Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan
diputar lagi.
g) Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml.
h) Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap
spesies tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas
kerapatannya 50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml.
6) Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma
Untuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan
haemocitometer: jumlah sel/grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma
dilakukan dengan menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein
diacetate (FDA). Medium kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1
tetes larutan pewarna FDA dan 1 tetes protoplasma suspensi tersebut
agar protoplas tercat dengan baik, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop.
Protoplasma yang mati berwarna merah dan yang viable tercatat hijau.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 87
7) Penanaman protoplasma (kultur protoplasma)
Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi
protoplas viable 100􀂱200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah
disediakan dan dikulturkan dan disimpan di tempat gelap pada
temperatur 28oC selama semalam. Kultur proplasma dipindahkan pada
cahaya rendah (10􀂱20 μmol.detik-1m-2) dengan cahaya lampu putih yang
dingin dan fotoperiode 16 jam, selama 2 hari. Kultur dipindahkan pada
intensitas cahaya yang lebih tinggi (50 􀂱 75 μmol.detik-1m-2).
Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media cair
yang diletakkan dalam cawan petri kecil atau media padat (dengan
pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh
lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya,
karena protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam
pada media awal yang diperkaya dengan osmoticum (misalnya sorbitol
atau mannitol) untuk menghindari plasmolisis. Salah satu contohnya
media kultur protoplasma tembakau.
Tabel 3. Formula Media Kultur Protoplasma Tembakau
Formula Mg/l Formula mg/l Formula mg/l
Ca(H2PO4).H2) 100,000 H2BO3 3,00 Mannitol 100.000,00
CCl2.2H2O 50,000 KI 0,75 Inositol 100,00
KNO3 500,000 MnSO4.4H2O 13,20 Nicotinic
acid
1,00
MgSO4.7H2O 50,000 Na2MoO4.2H2O 0,25 Pyridoxine-
HCl
1,00
NaH2PO4.2H2O 170,000 ZnSO4.7H2O 2,00 Thiamine-
HCl
10,00
(NH4)SO4 134,000 Sequestrene 330 28,00 2,4-D 0,10
CoCl2.6H2O 0,025 sucrose 10.000,00 NAA 1,00
CuSO4.5H2O 0,025 Glukose 18.000,00 BA 1,00
Catatan: pH 5,8
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 88
Penanaman protoplama ke dalam media dilakukan dengan cara
mencampur protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot
dengan pipet pasteur steril kemudian diteteskan pada cawan petri steril
(5􀂱10 tetes per petri). Cawan petri ditutup dengan parafilm selanjutnya
kultur diletakkan pada ruang kultur dengan suhu 25°C dan diberikan 16
jam penyinaran. Setiap 2 minggu ditambahkan media baru ke bagian
tetesan protoplasma tersebut.
8) Teknik kultur protoplasma
Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dalam medium
agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media
liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan
ke media agar. Media semisolid agar, agar yang digunakan untuk kultur
protoplasma adalah khusus, yaitu gel agar lunak, salah satunya adalah
agarose.
Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karena:
a) Mudah larut dan diserap
b) Beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah dalam
media agar
c) Tekanan osmotik media direduksi secara efektif
d) Kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan.
Kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal
yang berasal dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan
menjadi dua metode
a) Metode liquid tetes
Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 μl, suspensi protoplasma
dalam media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak
5-7 tetes. Cawan petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau
plastik wrap selanjutnya diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan
medium segar baru dengan cara meneteskan langsung pada tetesan
suspensi protoplasma yang telah mengalami pertumbuhan. Metode ini
biasanya baik untuk keperluan pengamatan dengan mikroskop.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 89
Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-tetesan suspensi menyatu
menjadi satu tetesan di pusat.
b) Metode tetes menggantung
Dengan menggunakan pipet volume 40-100 μl, suspensi protoplasma
diteteskan di dalam tutup cawan petri, selanjutnya cawan petri, ditutup
dengan menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma,
sehingga tetesan suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup
cawan petri tersebut.
9) Pembentukan dinding sel
Perkembangan protoplama diawali dengan regenerasi atau terbentuknya
dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada
beberapa spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi
melalui organogenesis atau embryogenesis.
10) Regenerasi protoplasma
Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih
sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan lain. Salah satu teknik
yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan
sel-sel lain (sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik
Nurse Culture. Untuk kultur satu protoplasma, nurse cells diletakkan
berdekatan dengan kultur protoplasmanya untuk mendukung pertumbuhan
dan perkembangan protoplasma. Teknik ini pertama kali diperkenalkan
oleh Muir dkk.
Tanaman yang dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau
bervariasi, disebut protoclonal variation. Apabila dalam penanaman
protoplasma ditambahkan mutagen ke dalam media, maka hasil regenerasi
akan berupa generasi baru.
Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair, umumnya ke dalam
media ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 mM BAP).
Setelah tunas terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dapat diakarkan.
Salah satu contoh media pengakaran protoplasma adalah 1/2 MS+3-
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 90
aminopyridine (untuk tembakau) atau picloran (untuk tebu). Plantlet yang
cukup besar selanjutnya diaklimatisai kemudian ditanam di lapangan.
d. Silangan Somatik
Secara alamiah persilangan terjadi hanya persilangan seksual antar kerabat
dekat dalam satu jenis (species). Persilangan seksual telah dipergunakan
bertahun-tahun untuk perbaikan tanaman budidaya. Sayangnya persilangan
seksual hanya terbatas pada kultivar-kultivar dalam satu spesies atau yang
terbaik pada beberapa spesies liar yang mempunyai hubungan kekerabatan
terdekat dengan tanaman budidaya. Adanya pembatas antar spesies
tanaman maka persilangan seksual kurang berfungsi.
Peleburan sel (fusi sel) somatik dapat mengarah ke pembentukan sel hibrid
viable yang dapat digunakan sebagai cara/metode untuk menghilangkan
pembatas antar spesies yang terjadi pada persilangan seksual. Protoplasma
tanaman merupakan ladang dari genetik sel somatik untuk perbaikan
tanaman. Teknik produksi hibrid melalui fusi protoplasma yang telah diisolasi
dari sel somatik (tubuh) secara invitro dan berkembang menjadi heterokarion
yang menjadi satu persilangan tanaman, dikenal sebagai Hybridisasi
somatik. Prosedur ini termasik mengabaikan unsur sel dalam hibridisasi.
Dalam persilangan somatik, inti dan sitoplasma dari kedua induk menyatu
dalam sel silangan. Kadang-kadang genom inti berasal hanya dari satu induk
yang melebur, tetapi kadang juga terjadi gen sitoplasmik (plastome) berasal
dari kedua induk yang ada dalam proses peleburan, hal ini dikenal dengan
cybrid (cytoplasmic hybrid).
Jadi teknik peleburan protoplasma dapat digunakan untuk menghilangkan
pembatas dari incompatibilitas dan sebagai manipulasi genetik dari sel
tanaman. Persilangan somatik bermanfaat untuk persilangan antar spesies
yang berbeda takson dari tingkat marga sampai tingkat divisi, untuk
menciptakan sel-sel dengan genetik baru, inti yang sebagus pada sitoplasmik
yang tidak mungkin didapatkan dengan metode persilangan seksual.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 91
Kegiatan persilangan somatik meliputi:
1) Peleburan protoplasma (fusi protoplasma)
2) Seleksi sel silangan
3) Identifikasi tanaman silangan.
e. Fusi Protoplasma
Peleburan protoplasma dari 2 (dua) genom yang berbeda dapat diperoleh
baik secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.
1) Metode peleburan spontan
Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran
protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah
yang dapat mengakibatkan peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada
protoplasma yang diisolasi dari kalus. Peleburan protoplasma dengan
teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang mempunyai asal
tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman.
2) Metode pemacuan peleburan
Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk
memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen)
yang berbeda jenis tanamannya. Larutan fusagen contohnya:
Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10%
sukrose dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35oC selama
5 menit selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit.
Subernatan dibuang dan pelet disimpan dalam water bath bersuhu 35oC
selama 30 menit. Pada beberapa saat protoplasma akan terjadi
peleburan. Agregat dituangkan secara hati-hati pada medium kultur yang
telah ditambah 0,1% NaNO3. Teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi
rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun (Power dkk., 1970
dalam Chawla, 2002).
Perlakuan ion calsium pada pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada
protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi
ditambahkan larutan fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 92
CaCl2.2H2O pada pH 10,5 selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50
g selama 3 menit. Selanjutnya tabung sentrifuge disimpan dalam water
bath bersuhu 37oC selama 40-50 menit hingga protoplasma melebur
(Keller dan Melchers, 1973 dalam Chawla, 2002).
Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode
peleburan protoplasma, metode ini yang berhasil dengan baik untuk
melebur protoplasma. Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan
PEG: 1 ml suspensi protoplasma dalam medium kultur dicampur dengan
1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW). Tabung digoyang selama 5 detik dan
biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya suspensi protoplasma tersebut
dipindahkan dari larutan PEG dengan cara mencucinya menggunakan
medium kultur sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa
pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi, sedangkan
kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion
binukleat rendah (Kao dan Michayluk, 1974 dalam Chawla, 2002).
Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di
dalam sel kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda
potensialnya, protoplasma diletakkan diantara barisan elektrodeelektrode.
Selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang pendek
elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma. Dalam
metode ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan
AC dari intensitas rendah untuk suspensi protoplasma. Kolektor
dielektroforetik diatur 1,5 V dan 1 MHz dan konduktivitas elektirk dari
medium suspensi kurang dari 10-5 detik/cm efek sebuah elektroforesis
dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan sepanjang alur
barisan elektrode. Tahap kedua injeksi aliran listrik DC dengan intensitas
tinggi (750-1000V/cm) dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-50
μdetik menyebabkan membran protoplasma robek dan akan
menghasilkan peleburan yang selanjutnya membran akan mengalami
reorganisasi. Teknik fusi elektro sangat sederhana, cepat dan efisien. Selsel
yang telah di fusikan secara eletronik tidak menunjukkan respon yang
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 93
sitotoxit, namun metode ini jarang digunakan. Contoh-contoh hasil
peleburan protoplasma dapat dilihat pada Tabel 4 dan 5 di bawah ini.
Tabel 4. Jumlah Kromosom dalam Beberapa Persilangan Interspesifik dan
Intergenerik yang Diproduksi melalui Peleburan Protoplasma
No Jenis Tanaman dengan
Jumlah Kromosomnya
Jumlah Kromosom Hasil
Persilangan
INTERSPESIFIK
1 Nicotiana tabacum (2n = 48)
+ N. glutinosa (2n = 24)
50-58
2 Nicotiana tabacum (2n = 48)
+ N. nesophila (2n = 48)
96
INTERGENERIK
No Jenis tanaman dengan jumlah
kromosomnya
Marga (Genus) baru
3 Nicotiana tabacum (2n = 24)
+ L. esculentum (2n = 24)
Nicotiopersicon
Tabel 5. Pemindahan Sifat Genetik melalui Peleburan Protoplasma
No Persilangan Somatik Sifat (Resistan)
1 Nicotiana tabacum +N. nesophila Tobacco mosaic
virus
2 Hordeum vulgare + Daucus carota Toleran
terhadap
pembekuan dan
garam
Meningkatkan kualitas Sifat
3 N. rustica + N. tabacum Kandungan
nikotin tinggi
Sifat Agronomik (dipindah melalui pembentukan cybrid)
4 N. tabacum + N. sylvestris Resisten
terhadap
Streptomycin
5 B. nigra + B. napus Resisten
terhadap
Hygromycim
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 94
2. TUGAS-6
a. Isolasi protoplasma dapat dilakukan dengan 2 (dua) cara yaitu dengan metode
mekanikal dan metode enzimatik. Jelaskan kelebihan dan kekurangan dari 2
(dua) metode tersebut!
b. Mengapa kalus dan suspensi sel dapat dijadikan sebagai sumber protoplasma?
c. Jelaskan 3 (tiga) prosedur kultur protoplasma!
d. Bagaimana caranya menghitung konsentrasi dan tes viabilitas protoplasma?
e. Jelaskan 3 (tiga) kegiatan persilangan somatik!
Jawaban tugas sebaiknya dikirimkan melalui e-mail ke alamat e-mail Dosen Anda
atau dapat dimasukkan/diposting ke blogger Anda, setelah itu Anda memberitahu
Dosen yang bersangkutan dapat melalui SMS atau cara yang lain.
3. TES FORMATIF-6
Soal Pilihan Ganda
Pilihlah jawaban yang Anda anggap paling benar
a. Salah satu kelemahan kultur protoplasma adalah .....
1) Sel yang digunakan mempunyai vakuola yang relatif besar
2) Viabilitas protoplasma rendah
3) Tingkat keberhasilan tinggi
4) Membutuhkan sedikit tenaga kerja
b. Enzim yang digunakan untuk menghancurkan dinding sel tumbuhan ada .....
macam
1) 2
2) 4
3) 3
4) 5
c. Peleburan protoplasma dari 2(dua) genom yang berbeda dapat diperoleh .....
1) Secara spontan
2) Dengan teknik pemacuan peleburan
3) Secara spontan dengan teknik pemacuan peleburan
4) Secara spontan dan fusi protoplasma
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 95
Soal Essay
Jawablah soal-soal di bawah ini dengan singkat dan jelas
a. Jelaskan 2 (dua) cara melakukan isolasi!
b. Jelaskan prosedur sterilisasi eksplan yang akan digunakan untuk kultur
protoplasma!
c. Bagaimana caranya menghitung konsentrasi dan tes viabilitas protoplasma?
4. UMPAN BALIK DAN TINDAK LANJUT-6
a. Bila jawaban Anda sudah mencapai 80% benar dibandingkan dengan kunci
jawaban tes formatif, Anda boleh melanjutkan ke materi berikutnya.
b. Bila jawaban Anda belum mencapai 80% benar dibandingkan dengan kunci
jawaban tes formatif, Anda harus mengulang kembali mempelajari materi
tersebut
5. KUNCI JAWABAN TES FORMATIF-6
Soal Pilihan Ganda
a. 2)
b. 3)
c. 3)
Soal Essay
a. 2 (dua) cara melakukan inisiasi protoplasma adalah:
1) Metode mekanikal: metode isolasi yang dilakukan dengan cara mengupas
dinding sel menggunakan alat bedah mikro (Klercker, 1892)
2) Metode enzimatik: isolasi protoplasma menggunakan bantuan enzim
(Cocking, 1960)
b. Prosedur sterilisasi eksplan yang akan digunakan untuk kultur protoplasma
adalah bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu
dicuci kemudian disterilkan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1􀂱2%
selama 10􀂱 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut
selanjutnya dicuci dengan air steril (3􀂱4 kali) untuk mencuci sisa sodium
hipoklorit pada eksplan.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 96
c. Caranya menghitung konsentrasi dan tes viabilitas protoplasma adalah ntuk
menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan haemocitometer: jumlah
sel/grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan dengan menggunakan
senyawa flourescent seperti fluresein diacetate (FDA). Medium kultur diambil 25
tetes selanjutnya ditambah 1 tetes larutan pewarna FDA dan 1 tetes
protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan baik, selanjutnya
dilihat di bawah mikroskop. Protoplasma yang mati berwarna merah dan yang
viable tercatat hijau.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 97
DAFTAR PUSTAKA
1. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited.
England. 236 p.
2. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of
Technology Printing Unit Garden's Point Campus. Queensland. 80p.
3. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general
principles and commercial applications. Queensland Department of
Primary Industries. Brisbane. 31 p.
4. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian
Bogor. Bogor. 304 h.
5. Han, H. (ed.), 1981. Plant tissue culture. Proceedings of syposium on plant
tissue culture. Pitman Publishing Pty Ltd., Melbourne. 531 p.
6. Sharp, R.R., D.A. Evans, P.V. Ammirato & Y. Yamada, 1985. Handbook of plant
cell culture. Vol. 2. Crop species. Collier Macmillan Publisher. London.
7. Street, H.E., 1974. Tissue culture and plant science. Academic Press.
London. 502 p.
8. Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory
exercises. 2nd Adt. CRC Press. New York
9. Vasil, K., 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. I. Laboratory
procedures and their aplication. Academic Press. Inc. London.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 98
LAMPIRAN
SATUAN ACARA PERKULIAHAN
PROGRAM D-4 VEDCA JOINT PROGRAM DENGAN POLITEKNIK NEGERI JEMBER
Bidang Peminatan : Kultur Jaringan Tanaman
Mata Kuliah : Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Jumlah SKS : 4 (2-2)
Trimester/Tahun : 7/2009
Dosen : Ir. Etty Ekawati, MP
Minggu
ke Tujuan Kompetensi Kompetensi/Sub Kompetensi Materi
Teori Praktik
1 Mahasiswa dapat mengenal
manfaat teknik mikropropagasi
dan metode perbanyakan
secara invitro
· Mampu mengenal manfaat
teknik mikropropagasi
· Mampu mengenal metode
perbanyakan secara invitro
· Manfaat teknik
mikropropagasi
· Metode perbanyakan
secara invitro
Melakukan observasi
pelaksanaan metode
perbanyakan secara invitro
2 Mahasiswa dapat mengenal
faktor-faktor yang
mempengaruhi keberhasilan
perbanyakan tanaman secara
invitro, dan macam-macam
mikropropagasi
· Mampu mengenal faktorfaktor
yang mempengaruhi
keberhasilan perbanyakan
tanaman secara invitro
· Mampu mengenal macammacam
mikropropagasi
· Faktor-faktor yang
mempengaruhi
keberhasilan
perbanyakan tanaman
secara invitro
· Macam-macam
mikropropagasi
Melakukan observasi
pelaksanaan metode
perbanyakan secara invitro
3 Mahasiswa dapat melakukan
kultur kalus dan kultur suspensi
· Mampu melakukan kultur
kalus
· Mampu melakukan kultur
suspensi
· Kultur kalus
· Kultur suspensi
· Kultur kalus
· Kultur suspensi
4 Mahasiswa dapat m elakukan
suspensi sel untuk memproduksi
senyawa metabolik sekunder
Mampu melakukan suspensi
sel untuk memproduksi
senyawa metabolik sekunder
Suspensi sel untuk
memproduksi senyawa
metabolik sekunder
Suspensi sel untuk
memproduksi senyawa
metabolik sekunder
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 99
5 Mahasiswa mampu mengenal
perkembangan produksi
senyawa metabolik sekunder
melalui kultur jaringan, prosedur
produksi senyawa metabolik
sekunder melalui kultur jaringan,
dan teknik peningkatan produksi
senyawa metabolik sekunder
melalui kultur jaringan
· Mampu mengenal
perkembangan produksi
senyawa metabolik
sekunder melalui kultur
jaringan
· Mampu melakukan prosedur
produksi senyawa metabolik
sekunder melalui kultur
jaringan
· Mampu melakukan teknik
peningkatan produksi
senyawa metabolik
sekunder melalui kultur
jaringan
· Perkembangan
produksi senyawa
metabolik sekunder
melalui kultur jaringan
· Prosedur produksi
senyawa metabolik
sekunder melalui kultur
jaringan
· Teknik peningkatan
produksi senyawa
metabolik sekunder
melalui kultur jaringan
Melakukan prosedur
produksi senyawa
metabolik sekunder
melalui kultur jaringan
6 Mahasiswa dapat mengenal
kegunaan tanaman haploid
dalam pemuliaan tanaman dan
teknik mendapatkan tanaman
haploid secara invitro
· Mampu mengenal kegunaan
tanaman haploid dalam
pemuliaan tanaman
· Mampu melakukan teknik
mendapatkan tanaman
haploid secara invitro
· Kegunaan tanaman
haploid dalam
pemuliaan tanaman
· Teknik mendapatkan
tanaman haploid
secara invitro
Teknik mendapatkan
tanaman haploid secara
invitro
7 U T S
8 Mahasiswa dapat melakukan
kultur serbuk sari (pollen culture)
dan kultur bakal buah (ovule
culture)
· Mampu melakukan kultur
serbuk sari (pollen culture)
· Mampu melakukan kultur
bakal buah (ovule culture)
· kultur serbuk sari
(pollen culture)
· kultur bakal buah
(ovule culture)
· kultur serbuk sari (pollen
culture)
· kultur bakal buah (ovule
culture)
9 Mahasiswa dapat mengenal
perkembangan gametofit betina,
melakukan penyerbukan
(polinasi) dan pembuahan
(fertilization)
· Mampu mengenal
perkembangan gametofit
betina
· Mampu melakukan
penyerbukan (polinasi)
· Mampu melakukan
pembuahan (fertilization)
· Perkembangan
gametofit betina
· Penyerbukan (polinasi)
· Pembuahan
(fertilization)
· Penyerbukan (polinasi)
· Pembuahan
(fertilization)
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 100
10 Mahasiswa dapat mengenal
kendala dalam persilangan,
melakukan prosedur umum
pembuahan invitro, dan
melakukan aplikasi fertilisasi
invitro
· Mampu mengenal kendala
dalam persilangan
· Mampu melakukan prosedur
umum pembuahan invitro
· Mampu melakukan aplikasi
fertilisasi invitro
· Kendala dalam
persilangan
· Prosedur umum
pembuahan invitro
· Aplikasi fertilisasi
invitro
Aplikasi fertilisasi invitro
11 Mahasiswa dapat mengenal
penggolongan kultur embrio dan
melakukan aplikasi praktis kultur
embrio
· Mampu mengenal
penggolongan kultur embrio
· Mampu melakukan aplikasi
praktis kultur embrio
· Penggolongan kultur
embrio
· Aplikasi praktis kultur
embrio
Aplikasi praktis kultur
embrio
12 Mahasiswa dapat melakukan
teknik dasar kultur embrio dan
dapat mengenal contoh aplikasi
komersial kultur embrio
· Mampu melakukan teknik
dasar kultur embrio
· Mampu mengenal contoh
aplikasi komersial kultur
embrio
· Teknik dasar kultur
embrio
· Contoh aplikasi
komersial kultur embrio
Teknik dasar kultur embrio
13 Mahasiswa dapat mengenal
pengertian kultur protoplasma
dan organ sebagai sumber
protoplas, serta dapat
melakukan prosedur kultur
protoplasma
· Mampu mengenal
pengertian kultur
protoplasma
· Mampu mengenal dan organ
sebagai sumber protoplas
· Mampu melakukan prosedur
kultur protoplasma
· Pengertian kultur
protoplasma
· Organ sebagai sumber
protoplas
· Prosedur kultur
protoplasma
kultur protoplasma
14 Mahasiswa dapat melakukan
silangan somatik dan fusi
protoplasma
· Mampu melakukan silangan
somatik
· Mampu melakukan fusi
protoplasma
· Silangan somatik
· Fusi protoplasma
· Fusi protoplasma
· Silangan somatik
15 U A S
16 Remidiasi
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 101
DAFTAR PUSTAKA
1. Bais HP, Sudha G, George J and Ravishankar GA, 2001. Influence of
exogenous hormones on growth and secondary metabolite production
in hairy root cultures of Cichorium intybus L. cv. Lucknow Local. Invitro
Cellular and Developmental Biology Plant 37 (2): 293-299.
2. Bohm H., 1980. The formation of secondary metabolites in plant tissue and cell
cultures. In: Vasil I.K. (Ed): International Review of Cytology :
Perspectives in Plant Cell and Tissue Culture. Academic Press Inc.,
Yew Yok. pp. 183 􀂱 208.
3. Chawla, H.S. 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd Edt. Science
Publishers, Inc. New Hampshire.
4. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture.
Cambridge University Press. London. 178 p.
5. George E.F. and P.D. Sherington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture:
Handbook and Directory for Commercial Laboratories. Exegetics,
England. 709 p.
6. George E.F., 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: The Technology.
Exegetics, England. 574 p.
7. Kazufumi Y, 2001. Root-specific production of secondary metabolites:
Regulation of shikonin biosynthesis by light in Lithospermum
erythrorhizon. Natural Medicines 55 (2): 49-54.
8. Keinanen M, Oldham NJ, Baldwin IT, 2001. Rapid HPLC screening of
jasmonate-induced increases in tobacco alkaloids, phenolics, and
diterpene glycosides in Nicotiana attenuata. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 49 (8): 3553-3558.
9. Majada JP, Sierra MI dan Sanchez TR, 2000. One step more towards taxane
production through enhanced Taxus propagation. Plant Cell Reports
19 (8): 825-830.
10. Roman K, Marketa S, Jan V, 1999. Gas chromatographic determination of Salk(
en)ylcysteine sulfoxides. Journal of Chromatography 862 (1): 85-
94.
Teknik Mikropropagasi Tanaman Perkebunan
Bidang Peminatan Kultur Jaringan Tanaman, Program D-4 PJJ 102
11. Verpoorte R, Heijden VR, Hoopen HJG, Memelink J, 1999. Metabolic
engineering of plant secondary metabolite pathways for the production
of fine chemicals. Biotechnology Letters 21 (6): 467-479.
12. Verpoorte R, Heijden VR, Memelink J, 2000. Engineering the plant cell factory
for secondary metabolite production. Transgenic Research 9 (4-5):
323-343.
13. Wagner H., S. Baht, E.M. Zgainski, 1983. Plant Drug Analysis. Springer-
Verlag, Berlin, New York.

read more...